1、背景與目的:
　　目前,肺癌的發(fā)病率位居我國男性癌癥首位。其中非小細胞肺癌約占肺癌的80％左右,傳統(tǒng)的治療方法,肺癌5年生存率僅15%左右。近年來NSCLC的分子靶向治療藥物,如吉非替尼和厄洛替尼等,因其針對性強,不良反應小,療效確切被越來越多地應用于臨床治療中,然而分子靶向藥物不能有效地清除病灶,后期往往會有耐藥發(fā)生,導致腫瘤復發(fā)進展。因此,對分子靶向藥物耐藥機制的研究,已成為目前亟待解決的問題,也是我們課題組努力研究的方向。A

2、BCG2,是 ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運超家族成員之一,能夠通過其外排泵作用促進細胞內(nèi)藥物主動外排,介導多種腫瘤耐藥[1][2]。本課題組前期研究證實,A549獲得性耐厄洛替尼細胞(A549/ER)相對于正常 A549細胞 ABCG2表達量明顯升高。我們由此推測,厄洛替尼的耐藥可能是由 ABCG2介導,但具體機制尚不明了。PI3K/AKT信號通路是EGFR的下游,參與厄洛替尼的藥物作用。磷醇酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶( phpsphatidy

3、linositol3-kinase/ serine-threonine kinase,PI3K/AKT)信號通路通過影響下游AKT的活化狀態(tài),參與并調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的細胞生物學過程。因PI3K/AKT通路是厄洛替尼發(fā)揮作用的主要通路,所以我們認為ABCG2在NSCLC厄洛替尼耐藥中起作用可能與PI3K/AKT信號通路調(diào)控有關(guān)。本研究采用 MTT、Real-time RT-PCR及 western-blot方法初步探討 A549及A549

4、/ER細胞中ABCG2表達與PI3K/AKT信號通路的調(diào)控關(guān)系,并在此基礎(chǔ)上使用PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002和PI3K/AKT信號通路激活劑IGF-1進一步探討ABCG2在非小細胞肺癌厄洛替尼耐藥中的機制。
　　材料和方法:
　　1.厄洛替尼對肺腺癌細胞系A(chǔ)549及A549/ER的影響及機制研究:培養(yǎng)人NSCLC細胞株A549及A549/ER,加入1μmol/L、5μmol/L、25μmol/L厄洛替尼12

5、、24、48h后,用MTT(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide)檢測細胞增殖。Real-time RT-PCR和 western-blot檢測 Akt(serine-threonine protein kinase)和ABCG2(ATP-binding cassette G2)的表達。
　　2. PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002

6、對肺腺癌細胞系A(chǔ)549及A549/ER的影響:培養(yǎng)人NSCLC細胞株A549和A549/ER,加入20μmol/L LY294002抑制劑,MTT、Real-time RT-PCR和western-blot檢測Akt和ABCG2表達。流式細胞儀檢測藥物處理48h后Rh123外排情況。
　　3. IGF-1可以激活PI3K/AKT信號通路,我們用其激活信號通路并研究對肺腺癌細胞系A(chǔ)549及A549/ER細胞的影響:培養(yǎng)人NSCLC細

7、胞株A549及A549/ER細胞,加入100ng/ml IGF-1抑制劑, MTT、Real-time RT-PCR和western-blot檢測Akt和ABCG2表達。流式細胞儀檢測藥物處理48h后Rh123外排情況。
　　結(jié)果:
　　1.隨著時間的延長和劑量的增加厄洛替尼對A549細胞增殖的抑制作用增強;同樣時間劑量,12、24h時A549/ER細胞增殖不明顯,但48h后A549/ER細胞增殖顯著。厄洛替尼作用A549細

8、胞后,相較于未加入厄洛替尼的細胞,ABCG2 mRNA表達明顯下調(diào)且p-AKT、ABCG2蛋白表達亦下調(diào)。同樣時間、劑量的厄洛替尼作用A549/ER細胞后,A549/ER細胞中ABCG2 mRNA表達及p-AKT、ABCG2蛋白表達上調(diào)。
　　2. LY29400220μmol/L作用A549及A549/ER細胞后相較于未加抑制劑細胞, ABCG2 mRNA及p-AKT、ABCG2蛋白表達明顯下調(diào),且流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示A549

9、及A549/ER細胞在加入LY294002后相較于未加抑制劑細胞Rh123外排減少。
　　4. IGF-1100ng/ml作用A549及A549/ER細胞后相較于未加IGF-1細胞, ABCG2 mRNA及p-AKT、ABCG2蛋白表達明顯上調(diào),且流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示A549及A549/ER細胞在加入IGF-1后相較于未加IGF-1細胞Rh123外排增加。
　　結(jié)論:
　　1.我們發(fā)現(xiàn)厄洛替尼能夠以劑量、時間依賴性的

10、方式抑制 A549細胞增殖,但在A549/ER細胞中,12、24h時A549/ER細胞增殖改變不明顯,在48h時A549/ER細胞增殖明顯,認為隨著藥物作用時間的延長,藥物外排增加,細胞內(nèi)藥物濃度降低所致。并證實厄洛替尼對ABCG2基因及蛋白水平均有調(diào)節(jié),且該調(diào)節(jié)與PI3K/AKT信號通路p-AKT磷酸化程度有關(guān)。
　　2. PI3K/AKT抑制劑(LY294002)可以顯著下調(diào)A549和A549/ER細胞中ABCG2基因和蛋白表