1、膀胱腫瘤是我國(guó)泌尿外科最常見(jiàn)的腫瘤，其中多數(shù)為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌。膀胱腫瘤的主要特點(diǎn)是復(fù)發(fā)率高，可能的原因是膀胱腫瘤患者膀胱粘膜局部免疫功能低下、使得殘存腫瘤容易逃避免疫監(jiān)視，得以生存和形成復(fù)發(fā)。因此，非肌層浸潤(rùn)性膀胱腫瘤術(shù)后常輔以膀胱灌注化療或免疫療法以預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展?？ń槊?BacillusCalmette-Guerin，BCG)是目前最有效的免疫治療，有效激活膀胱粘膜局部免疫應(yīng)答是其抗腫瘤作用的主要機(jī)制，但BCG膀胱灌注等治療

2、仍不能完全預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和進(jìn)展。預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展仍是尚未完全解決的難題。 近年來(lái)，環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenase，COX-2)逐漸成為膀胱腫瘤研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究表明，COX-2在正常人膀胱上皮細(xì)胞中幾乎無(wú)表達(dá)，在人膀胱腫瘤細(xì)胞中表達(dá)則顯著增強(qiáng)，它與腫瘤的分化、凋亡、血管生成等生物學(xué)行為有關(guān)，且與腫瘤分級(jí)分期、進(jìn)展預(yù)后等有關(guān)。因此，COX-2可以作為膀胱腫瘤治療的新靶點(diǎn)。 有關(guān)COX-2與膀胱腫瘤的研

3、究是本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)的研究重點(diǎn)之一。本課題通過(guò)研究選擇性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布對(duì)BCG感染的人臍血源性樹(shù)突狀細(xì)胞(Cord bloodderived dendritic cell，CBDC)體外抗膀胱腫瘤免疫功能及對(duì)人膀胱腫瘤細(xì)胞株T24的體外增殖和凋亡的影響，探討塞來(lái)昔布的抗膀胱腫瘤效應(yīng)及其可能機(jī)制，并通過(guò)一個(gè)小規(guī)模臨床研究，初步了解塞來(lái)昔布對(duì)BCG膀胱灌注治療非肌層浸潤(rùn)性膀胱腫瘤的潛在的輔助治療效果。 本研究主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)

4、果如下： 第一部分，塞來(lái)昔布對(duì)BCG感染的人CBDC體外抗膀胱腫瘤免疫功能的影響 1．首先，從人臍血中分離單個(gè)核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)為樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，BCG刺激使其成熟。經(jīng)鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞具有典型DC形態(tài)學(xué)和表型特征。 2．分別加入培養(yǎng)基(空白對(duì)照)、BCG、BCG+PGE<,2>、BCG+塞米昔布等與DC共培養(yǎng)。ELISA法測(cè)定各組培養(yǎng)上清中Th1型細(xì)胞因子(IL-12)和Th2型細(xì)胞因子(IL-10)水平，結(jié)

5、果顯示BCG可同時(shí)增加DC的IL-12和IL-10分泌，提示無(wú)免疫漂移作用發(fā)生，而塞來(lái)昔布劑量依賴(lài)性地顯著增強(qiáng)BCG感染DC的IL-12的表達(dá)，抑制其IL-10表達(dá)：PGE<,2>的作用與此相反，提示塞來(lái)昔布可誘導(dǎo)偏向Th1型而PGE<,2>可誘導(dǎo)偏向Th2型免疫應(yīng)答的免疫漂移作用。 3．MTT法測(cè)定各組DC的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)性(MLR)，結(jié)果顯示塞來(lái)昔布顯著增加、而PGE<,2>則明顯抑制BCG感染的DC的混合淋巴反應(yīng)性。

6、 4．乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測(cè)定各組DC：激活的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)人膀胱腫瘤細(xì)胞株T24的細(xì)胞毒活性。結(jié)果顯示，塞來(lái)昔布顯著增強(qiáng)、而PGE<,2>則明顯抑制BCG感染的DC激活CTL的抗膀胱腫瘤細(xì)胞毒活性。 第二部分，研究塞來(lái)昔布對(duì)人膀胱腫瘤細(xì)胞株T24體外增殖和凋亡的影響 1．將貼壁生長(zhǎng)的T24細(xì)胞，分別與不同濃度塞來(lái)昔布、PGE<,2>以及PI-3K抑制劑LY294002共培養(yǎng)，MTT法測(cè)定塞米

7、昔布及PGE<,2>對(duì)T24細(xì)胞增殖活性的影響；分別與CM，DMSO(0.1％)，塞來(lái)昔布、PGE2以及LY294002共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀測(cè)定塞來(lái)昔布及PGE<,2>處理后T24細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示塞來(lái)昔布呈劑量依賴(lài)性顯著抑制貼壁生長(zhǎng)的T24細(xì)胞的增殖，增加T24細(xì)胞的凋亡；而PGE<,2>和對(duì)貼壁生長(zhǎng)的T24細(xì)胞增殖和凋亡無(wú)明顯影響。 2．建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，將懸浮生長(zhǎng)的T24細(xì)胞，分別與(2M，DMSO，塞來(lái)昔布、PGE

8、<,2>以及LY294002共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀測(cè)定塞米昔布及PGE<,2>處理后T24細(xì)胞的凋亡率(失巢凋亡，即脫壁作用誘導(dǎo)的凋亡現(xiàn)象)；分別與塞來(lái)昔布、PGE<,2>共培養(yǎng)，Western blot法檢測(cè)塞來(lái)昔布及PGE<,2>對(duì)PI-3K/Akt途徑活化的影響。結(jié)果表明，塞來(lái)昔布和LY294002顯著增加T24的失巢凋亡，而PGE<,2>顯著抑制T24細(xì)胞的失巢凋亡。Western blot結(jié)果提示，塞來(lái)昔布抑制、而PGE<,2>明

9、顯增加Akt磷酸化，提示塞來(lái)昔布和PGE<,2>對(duì)PI-3K/Akt途徑活化分別具有降低或增強(qiáng)作用，并且這種作用可能是對(duì)失巢凋亡的增強(qiáng)或抑制作用機(jī)制之一。 第三部分，口服塞來(lái)昔布膠囊對(duì)BCG膀胱灌注治療非肌層浸潤(rùn)性膀胱腫瘤療效影響的臨床初步研究。 42例非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌術(shù)后患者隨機(jī)分為2組，分別接受單純BCG治療和BCG膀胱灌注加塞來(lái)昔布膠囊口服聯(lián)合治療。ELISA法測(cè)定治療前后尿液細(xì)胞因子水平，觀察復(fù)發(fā)和進(jìn)展以及治療

10、相關(guān)副作用等情況，分析影響對(duì)塞米昔布治療的反應(yīng)性的因素。結(jié)果顯示： 1．兩組患者治療前尿液IL-12、IL-10水平的差異無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療后聯(lián)合治療組IL-12水平以及其治療前后增加值均顯著高于單純BCG組，而治療后IL-10水平以及其治療前后增加值均顯著低于單純BCG組，提示塞來(lái)昔布可誘導(dǎo)BCG激活的膀胱局部免疫應(yīng)答發(fā)生偏向Th1型的免疫漂移，從而增強(qiáng)膀胱局部的抗腫瘤免疫功能。 2．由于隨訪時(shí)間較短，目前尚

11、不能得出塞米昔布對(duì)BCG膀胱灌注預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展療效影響的準(zhǔn)確結(jié)論。 3．單純BCG治療組與聯(lián)合治療組比較，治療副作用無(wú)明顯差異。 4．對(duì)尿液細(xì)胞因子水平進(jìn)行的預(yù)后因素影響分析結(jié)果提示：65歲以上年齡組對(duì)塞來(lái)昔布治療的反應(yīng)性強(qiáng)于65歲以下年齡組；男性患者治療反應(yīng)性強(qiáng)于女性患者；高分期、分級(jí)以及多發(fā)、直徑大的腫瘤治療反應(yīng)性降低。其機(jī)制有待研究。 全文結(jié)論： 1．塞來(lái)昔布可增強(qiáng)BCG激活的Th1型免疫應(yīng)

12、答，抑制Th2型應(yīng)答，誘導(dǎo)向Th1型應(yīng)答漂移，從而增強(qiáng)BCG激活的抗腫瘤免疫效應(yīng)。其機(jī)制是通過(guò)抑制COX-2活性下調(diào)PGE<,2>的表達(dá)，從而抑制PGE<,2>誘導(dǎo)的DC的Th2型細(xì)胞因子IL-10分泌及其對(duì)Th1型細(xì)胞因子IL-12的拮抗作用，使得IL-12表達(dá)升高。 2．塞來(lái)昔布具有雙重抗腫瘤作用，即對(duì)BCG激活的免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用，以及直接對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用和凋亡的誘導(dǎo)作用。兩種作用均與塞來(lái)昔布對(duì)COX-2的抑制