1、研究背景：
　　阿爾茲海默癥(Alzheimer‘s Disease，AD)是一種最為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，為癡呆的最主要類型。目前―Aβ假說‖被廣泛地接受為AD最主要的發(fā)病機(jī)理，即老年斑的主要組成成分——β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)是AD發(fā)病進(jìn)程的中心機(jī)制，其在特定腦區(qū)內(nèi)聚集，引發(fā)相應(yīng)的神經(jīng)毒性作用，造成突觸損傷，神經(jīng)元死亡，從而導(dǎo)致了AD患者記憶衰退和認(rèn)知功能障礙等相應(yīng)癥狀的產(chǎn)生。
　　目前，AD的

2、治療研究策略主要包括三個(gè)方面：一是開發(fā)新的低毒性的擬膽堿藥物；二是神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)的應(yīng)用，包括直接腦室灌注神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾細(xì)胞的腦內(nèi)移植治療；三是干細(xì)胞的移植治療。但這些療法基本在于減慢神經(jīng)元的退變或加速神經(jīng)元的產(chǎn)生，并沒有從根本上阻止AD患者的病變，其遠(yuǎn)期治療前景不容樂觀。而中醫(yī)藥臨床表明，以石菖蒲為主的藥方是治療AD方劑的基本結(jié)構(gòu)，位居單味藥使用頻次第1位，療效肯定。但石菖蒲抗AD的藥效部位及抗AD的―Aβ‖機(jī)制尚未闡

3、明，影響了石菖蒲抗AD療效的進(jìn)一步提高。
　　我室前期工作證明，石菖蒲揮發(fā)油部位對AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有明顯提升作用，作用機(jī)制可能與其拮抗凋亡相關(guān)因子表達(dá)有關(guān)，提示揮發(fā)油部位有可能用于AD的防治。為進(jìn)一步探討石菖蒲揮發(fā)油部位抗AD及其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的有效成分，為石菖蒲抗AD及用于神經(jīng)保護(hù)藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)首先用Aβ1-42寡聚體對體外培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元進(jìn)行優(yōu)化篩選，建立了 Aβ1-42寡聚體致神經(jīng)元損傷模型。在

4、此模型上探討β-細(xì)辛醚（β-asarone）、丁香酚（Eugenol）以及β-細(xì)辛醚聯(lián)合丁香酚共孵育對 Aβ1-42致神經(jīng)元損傷模型的保護(hù)作用及機(jī)制，為石菖蒲抗AD及用于神經(jīng)保護(hù)藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究目的：
　　1.觀察β-細(xì)辛醚和丁香酚對正常狀態(tài)下原代皮層神經(jīng)元和PC12細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞活力的影響，初步了解β-細(xì)辛醚和丁香酚的神經(jīng)保護(hù)作用；
　　2.觀察β-細(xì)辛醚、丁香酚及β-細(xì)辛醚聯(lián)合丁香酚共孵育對Aβ

5、1-42寡聚體誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元和PC12細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)理。
　　研究方法：
　　實(shí)驗(yàn)一
　　1．首先取胎鼠的皮層組織進(jìn)行原代皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)，培養(yǎng)第六天進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定神經(jīng)元；
　　2． Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元損傷模型的建立，ELISA檢測相關(guān)因子的釋放水平；
　　3．觀察β-細(xì)辛醚和丁香酚對皮層神經(jīng)元的細(xì)胞活力的影響；
　　4．原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)第六天

6、加入Aβ1-42寡聚體建立細(xì)胞模型，24小時(shí)后再用
　　β-細(xì)辛醚和丁香酚作用于細(xì)胞。三天后提取蛋白進(jìn)行凋亡相關(guān)因子的檢測；實(shí)驗(yàn)二
　　1.石菖蒲主要有效成分β-細(xì)辛醚和丁香酚對正常狀態(tài)下PC12細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活力的影響；
　　2.建立PC12細(xì)胞的Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)損傷模型；
　　3. PC12細(xì)胞培養(yǎng)第六天加入Aβ1-42寡聚體建立細(xì)胞模型，24小時(shí)后再用β-細(xì)辛醚和丁香酚作用于細(xì)胞。三天后提取RNA進(jìn)行

7、凋亡相關(guān)基因的檢測；
　　4.通過Tunel法探討β-細(xì)辛醚和丁香酚對Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)理。
　　研究結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一：
　　1.培養(yǎng)至第六天的原代皮層神經(jīng)元胞體的突起明顯，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，神經(jīng)元標(biāo)志物呈陽性；
　　2.通過ELISA檢測TNF-α的釋放水平，建立起Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元損傷模型；
　　3.培養(yǎng)至第三天的皮層神經(jīng)元分別與10-10-10

8、-5Mβ-細(xì)辛醚、丁香酚以及β-細(xì)辛醚聯(lián)合丁香酚共孵育24h，與正常培養(yǎng)的神經(jīng)元相比，10-6β-細(xì)辛醚和10-7M丁香酚組細(xì)胞存活率最高；
　　4. Western blotting技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白，顯示Aβ1-42寡聚體作用于皮層神經(jīng)元6h后，促凋亡蛋白Bax表達(dá)開始增加，至24h達(dá)到較高水平；與之相反，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)隨Aβ1-42寡聚體作用時(shí)間延長逐漸降低；
　　5.10-10-10-5Mβ-細(xì)辛醚和丁香

9、酚可明顯拮抗 Aβ1-42寡聚體引起的促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)以及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降。
　　實(shí)驗(yàn)二：
　　1.培養(yǎng)至第三天的PC12細(xì)胞與10-10-10-5Mβ-細(xì)辛醚和丁香酚分別共孵育24h，與正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞相比，10-6β-細(xì)辛醚和10-7M丁香酚組細(xì)胞存活率最高；
　　2. RT-PCR技術(shù)檢測凋亡相關(guān)基因，顯示 Aβ1-42寡聚體作用于PC12細(xì)胞后，促凋亡蛋白Bax表達(dá)開始增加，抗凋亡蛋白

10、Bcl-2表達(dá)逐漸降低；
　　3.10-10-10-5Mβ-細(xì)辛醚和丁香酚可明顯拮抗Aβ1-42寡聚體引起的PC12細(xì)胞促凋亡基因Bax表達(dá)上調(diào)以及抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)下降；
　　4. TUNEL方法檢測PC12細(xì)胞凋亡：β-細(xì)辛醚、丁香酚及其混合物的預(yù)孵育組，與Aβ1-42寡聚體對照組相比較，陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。β-細(xì)辛醚聯(lián)合丁香酚用藥組優(yōu)于單體的單獨(dú)作用組。
　　結(jié)論：
　　1. Aβ1-42寡聚體能顯