1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾接懶∈罂谷薈D44單克隆抗體(HI313)對(duì)髓系白血病細(xì)胞增殖、分化的影響。構(gòu)建HI313單鏈抗體(ScFv)，為進(jìn)一步治療性抗體開發(fā)打下基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法：通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，比較小鼠抗人CD44單克隆抗體HI313與HI44a的親合力及競(jìng)爭(zhēng)抑制作用；以胎盤蘭計(jì)數(shù)和MTS法檢測(cè)HI313對(duì)白血病細(xì)胞系增殖抑制的影響；AnnexinV/PI和TheCycleTESETMPLUSDNAReagentKit檢測(cè)HI313對(duì)

2、NB4細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期影響；以及HI313對(duì)AML病人血細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用；RT-PCR的方法克隆小鼠雜交瘤HI313的抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，利用overlap-PCR方法構(gòu)建HI313-ScFv融合基因，定向克隆入原核表達(dá)載體pET22b，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b/HI313-SeFv。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入BL21感受態(tài)菌株，在IPTG存在條件下，誘導(dǎo)表達(dá)HI313單鏈抗體。所得融合蛋白經(jīng)復(fù)性、鎳柱純化后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其與天然細(xì)胞

3、膜CD44蛋白的結(jié)合活性和特異性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：通過THP-1和KGla細(xì)胞的檢測(cè)，HI313克隆的相對(duì)親合力分別為1.2nM和1.34nM；H144a克隆的相對(duì)親和力分別為3.5nM和5.89nM；免疫競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明HT313與HI44a識(shí)別不同抗原表位；HI313單克降抗體對(duì)NB4白血病細(xì)胞系具有強(qiáng)烈的抑制增殖作用，并使NB4細(xì)胞周期停留在G0/G1期；對(duì)AML病人血細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用結(jié)果顯示HI313可使髓系表面的成熟標(biāo)志表達(dá)量

4、增加。擴(kuò)增HI1313重鏈可變區(qū)基因357bp，HI313輕鏈可變區(qū)基因339bp；成功構(gòu)建HI313-ScFv單鏈抗體，能與KGla細(xì)胞表面抗原結(jié)合。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：HI313單克隆抗體具有高親和力；且與H144a克隆結(jié)合的不是一個(gè)抗原表位；HI313對(duì)NB4細(xì)胞具有增殖抑制作用，作用機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期相關(guān)；HI313能有效誘導(dǎo)AML病人血細(xì)胞的分化，并對(duì)AML病人的各亞型有一定的促分化作用，提示此抗體具有針對(duì)A