1、肝癌是惡性程度極高，預(yù)后極差的惡性腫瘤。目前各種治療手段并不能從根本上改變肝癌患者的預(yù)后?；?病毒治療成為一種新的治療手段開始應(yīng)用于肝癌的治療。白細(xì)胞介素在免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)中起到重要的作用，其中IL-21主要由活化的CD4+T細(xì)胞分泌，能增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞及活化的NK細(xì)胞的功能，從而有效增強(qiáng)機(jī)體的天然免疫以及特異性免疫反應(yīng)，對(duì)肝癌具有良好的治療效果，本課題選擇刺激T細(xì)胞增殖、抗腫瘤的IL-21基因，并利用腺病毒載體攜帶該基因?qū)Ω伟┻M(jìn)行治療，

2、同時(shí)利用T細(xì)胞作為細(xì)胞載體攜帶腺病毒逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，從而使腺病毒有效地到達(dá)腫瘤部位，提高靜脈注射后腺病毒到達(dá)腫瘤細(xì)胞的效率，以便更有效的治療肝癌。
　　 ITR是腺相關(guān)病毒(Adeno-associated Virus，AAV)基因組的末端重復(fù)序列，每個(gè)ITR長145bp。其中前125bp可形成一個(gè)T形的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)小回紋結(jié)構(gòu)(palindrome)組成，旁邊為一個(gè)較大的回紋結(jié)構(gòu)。ITR的序列可有兩種構(gòu)型：flip(B回

3、紋接近3’端)或flop(C回紋接近3’端)。一個(gè)特定分子AAV的兩個(gè)末端形成flip或flop的機(jī)率都相等。單鏈形式的AAVITR容易形成的T型發(fā)夾結(jié)構(gòu)，還可能形成另外的構(gòu)型。ITR序列是AAV病毒的復(fù)制、整合、拯救和包裝所必需的順式作用元件。本實(shí)驗(yàn)選擇構(gòu)建的腺病毒為非增殖型腺病毒，其在宿主細(xì)胞內(nèi)存在的數(shù)量完全由剛開始進(jìn)入細(xì)胞的病毒滴度決定，為了使其在宿主內(nèi)的數(shù)量擴(kuò)增，本課題在腺病毒載體的末端加入了ITR結(jié)構(gòu)，即包裝出來的腺病毒包含A

4、AV的ITR結(jié)構(gòu)。因此命名病毒為Ad5/AAV、Ad5F35/AAV。腺病毒能夠高效感染多種細(xì)胞，其基因組可插入較大的外源日的基因片段，并能夠快速啟動(dòng)目的基因表達(dá)，但其基因組不能夠復(fù)制而影響了目的基因的表達(dá)，而腺相關(guān)病毒的基因組可因其末端反向重復(fù)序列ITR的存在發(fā)生復(fù)制，使目標(biāo)基因在靶細(xì)胞中長期表達(dá)。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要有以下三部分組成：
　　 一、表達(dá)hIL-21的腺病毒載體的構(gòu)建和制備
　　 使用PCR方法將h

5、IL-21基因從pDCC318-hIL-21模板中擴(kuò)增出來，然后使用限制性內(nèi)切酶SαlI、BamHI酶切hIL-21和pDC759，然后將處理后的片段連接到載體片段上，即得到質(zhì)粒載體pDC759-hIL-21。將質(zhì)粒載體pDC759-hIL-21與腺病毒骨架載體pAd5、pAd5F35共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，10天后出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化，提取病毒基因組進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的腺病毒命名為Ad5/AAV-hIL-21、Ad5F3

6、5/AAV-hIL-21。經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增、氯化銫密度梯度離心純化、TCID50測得病毒Ad5/AAV-hIL-21、Ad5F35/AAV-hIL-21滴度分別為8.95×109pfu/ml、2.65×1010pfu/ml。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也構(gòu)造了攜帶含有CopGFP的5型以及35型腺病毒分別命名為Ad5/AAV-CopGFP、Ad5F35/AAV-CopGFP，二者的滴度分別為5.15×109pfu/ml、7.1×109pfu/ml。

7、>　　 二、CIK細(xì)胞的培養(yǎng)以及體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)
　　 這部分的研究主要是基于構(gòu)建好的病毒其在體外條件下，基因組表達(dá)框的表達(dá)能力的一個(gè)鑒定以及在體外條件下5型腺病毒與35型腺病毒對(duì)CIK細(xì)胞感染能力的對(duì)比；探索不同MOI情況下最大感染能力的優(yōu)化和選擇，以便推論出最優(yōu)的感染條件。為了得到這個(gè)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)做了如下實(shí)驗(yàn)研究：
　　 首先，本實(shí)驗(yàn)選用Ad5/AAV-CopGFP、Ad5F35/AAV-CopGFP以不同MOI感染C

8、IK細(xì)胞，其MOI的控制梯度分別為1，5，10,50,100,1000。感染48、96小時(shí)后分別在熒光顯微鏡下觀察其各種條件下的熒光強(qiáng)度，本實(shí)驗(yàn)證明了Ad5F35/AAV-CopGFP對(duì)CIK細(xì)胞的感染能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于Ad5/AAV-CopGFP對(duì)CIK細(xì)胞的感染能力。并且，隨著MOI的增加Ad5F35/AAV-CopGFP對(duì)CIK細(xì)胞的感染能力逐漸增強(qiáng)，但是在MOI增加到1000的時(shí)候Ad5F35/AAV-CopGFP對(duì)CIK細(xì)胞的感染能

9、力會(huì)有所下降，原因是因?yàn)樵谠揗OI的條件下，Ad5F35/AAV-CopGFP對(duì)CIK細(xì)胞有一定的殺傷作用，所以在MOI為50的條件下Ad5F35/AAV-CopGFP對(duì)CIK細(xì)胞的感染能力是較為合適的，本實(shí)驗(yàn)選擇該條件為下面實(shí)驗(yàn)的一個(gè)參照比值。
　　 其次，本實(shí)驗(yàn)用Ad5/AAV-hIL-21、Ad5F35/AAV-hIL-21對(duì)SMMC-7721細(xì)胞株進(jìn)行感染，MOI的梯度設(shè)置為0,1，5，10,20。在病毒感染細(xì)胞48hr

10、后收取上清進(jìn)行檢測，使用ELISA試劑盒檢測hIL-21的表達(dá)量，同時(shí)使用Ad5F35/AAV-hIL-21對(duì)CIK細(xì)胞進(jìn)行感染，MOI的梯度設(shè)置為0,1，5，10,50,100,使用ELISA試劑盒檢測hIL-21的表達(dá)量。檢測的結(jié)果顯示Ad5/AAV-hIL-21、Ad5F35/AAV-hIL-21對(duì)SMMC-7721細(xì)胞株的感染能力相似，并且表達(dá)情況也差的不是很大，在MOI為20的情況下hIL-21的表達(dá)量較高。
　　 再

11、次，本實(shí)驗(yàn)對(duì)CIK細(xì)胞的生長進(jìn)行一個(gè)比較系統(tǒng)的研究，并且繪制了22天CIK細(xì)胞的生長曲線，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著轉(zhuǎn)袋后培養(yǎng)，第六天以后，調(diào)節(jié)好CIK的密度為一個(gè)較高的水平，在以后的時(shí)間CIK的生長呈現(xiàn)倍增的生長趨勢(shì)。在培養(yǎng)第20天以后CIK的數(shù)量基本上維持不變，其生長狀態(tài)開始出現(xiàn)停滯，在以后的時(shí)間里CIK的生長出現(xiàn)衰退的狀況，因此，在CIK細(xì)胞培養(yǎng)到12天以后開始作為荷瘤小鼠治療的時(shí)間。
　　 三、表達(dá)hIL-21的CIK細(xì)胞體內(nèi)

12、治療肝癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　 本實(shí)驗(yàn)皮下注射5×106個(gè)/只SMMC-7721細(xì)胞用于建立裸鼠肝癌模型。
　　 1、CIK細(xì)胞基因治療系統(tǒng)對(duì)裸鼠移植瘤的抑制作用，CIK/Ad5F35/AAV-hIL-21治療組療效明顯優(yōu)于PBS對(duì)照組，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2、CIK細(xì)胞基因治療系統(tǒng)對(duì)荷瘤裸鼠生存期的影響。PBS對(duì)照組在治療開始后第27天開始出現(xiàn)死亡，幾天內(nèi)全部死亡。直至對(duì)照組小鼠全部死亡

13、時(shí)，CIK/Ad5F35/AAV-hIL-21治療組小鼠全部存活。
　　 基于體外實(shí)驗(yàn)的一個(gè)研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選用裸鼠作為荷瘤小鼠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并且本實(shí)驗(yàn)選擇SMMC-7721細(xì)胞作為荷瘤小鼠造模的細(xì)胞，在每個(gè)小鼠的皮下注射5×106個(gè)細(xì)胞。在裸鼠成瘤以后，進(jìn)行治療，治療的分組在下面的實(shí)驗(yàn)研究中會(huì)進(jìn)行詳細(xì)的介紹。治療的療效主要分為，效果指標(biāo)和生存指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示當(dāng)Ad5F35/AAV-hIL-21感染CIK細(xì)胞后尾靜脈回輸

14、到荷瘤小鼠體內(nèi)之后，腫瘤的治療效果較為顯著。
　　 結(jié)論：本課題成功構(gòu)建了同時(shí)攜帶HIL-21基因的嵌合型腺病毒Ad5F35/AAV-hIL-21，并且該病毒高效感染CIK細(xì)胞，且高表達(dá)hIL-21.。CIK/Ad5F35/AAV-hIL-21治療系統(tǒng)能顯著抑制裸鼠移植瘤和延長裸鼠生存期。該方案綜合了腫瘤細(xì)胞治療和基因-病毒治療的雙重優(yōu)勢(shì)，克服了基因-病毒治療系統(tǒng)體內(nèi)運(yùn)輸病毒效率低的缺陷，也彌補(bǔ)了單純腫瘤細(xì)胞治療效果差的不足，對(duì)