1、人胚胎干細胞（Human embryonic stem cell,hESC）來源于早期人類胚胎的內(nèi)細胞團，它可以分化為內(nèi)、中、外三個胚層的各種細胞及組織。胚胎干細胞的這些特點使得其在再生醫(yī)學領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛能，但是在此之前，它仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)，即安全性問題，主要包括遺傳學及表觀遺傳學兩方面的內(nèi)容。有研究證實，人胚胎干細胞（hESC）具有極度傾斜性 X染色體失活（X chromosome inactivation,XCI）現(xiàn)象，而某些

2、基因組失衡且表觀異常疾病（如X染色體連鎖智力發(fā)育遲緩類疾?。┮脖憩F(xiàn)極度傾斜的XCI。本課題組前期課題也發(fā)現(xiàn)，傾斜性XCI的hESC存在DNMT、Nanog等基因區(qū)域微小基因組失衡。于是我們推測，除了DNA甲基化及組蛋白修飾外，基因組水平的微小失衡與hESC傾斜性XCI可能也有相關(guān)性。本研究利用微陣列單核苷酸多態(tài)性技術(shù)對9株 hESCs基因組穩(wěn)定性檢測，發(fā)現(xiàn)了一些胚胎干細胞基因組存在拷貝數(shù)變異（copy number variation,

3、CNV）及雜合性缺失（loss of heterozygosity,LOH）。結(jié)合對9株hESCs中X染色體失活狀態(tài)分析發(fā)現(xiàn)， hESC中X染色體傾斜性失活可能與基因組CNV/LOH區(qū)域涉及的某些基因功能改變有一定的相關(guān)性，并通過生物信息學分析預(yù)測可能的調(diào)控通路。
　　研究目的:
　　本課題以hESC為研究對象，結(jié)合微陣列單核苷酸多態(tài)性技術(shù)等方法，對hESC基因組穩(wěn)定性進行檢測，并在全基因組內(nèi)尋找與X染色體傾斜性失活高度關(guān)聯(lián)

4、的拷貝數(shù)變異（CNV）、雜合性缺失（LOH），篩選出候選基因，明確基因組失衡影響X染色體傾斜性失活的可能機制，豐富干細胞遺傳安全性及表觀遺傳調(diào)控機制的理論。
　　研究方法:
　　1．利用本實驗室前期建立的10株hESCs系，復蘇并體外培養(yǎng)傳代。進行hESC表面抗原SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81等染色鑒定。
　　2．10株hES培養(yǎng)至10代左右，收集細胞，提取基因組DNA。
　　3．

5、對各細胞DNA進行人雄激素受體基因（HUMARA）多態(tài)性片段分析，判斷其雜合性，選擇HUMARA基因雜合子進行X染色體失活分析。
　　4．使用EpiTect Bisulfite Kit試劑盒(QIAGEN)，將基因組DNA進行用重亞硫酸鹽處理,隨后行引物特異性PCR反應(yīng)，并對產(chǎn)物進行多態(tài)性片段分析。
　　5．利用微陣列單核苷酸多態(tài)性技術(shù)，分別檢測隨機失活組及傾斜性失活組hESCs細胞提取的基因組DNA，尋找與X染色體傾斜性失

6、活可能相關(guān)的CNV/LOH。
　　6．利用UCSC、NCBI及DECIPHER等數(shù)據(jù)庫，分析相關(guān)CNV/LOH關(guān)鍵區(qū)域可能與X染色體傾斜性失活相關(guān)的基因，進一步探索可能的基因調(diào)控通路。
　　7．分別選取2株X染色體傾斜性失活及隨機失活的hESCs，細胞提取RNA，利用熒光定量PCR對傾斜組胚胎干細胞基因組 LOH區(qū)域涉及的4個lncRNA即XIST,TSIX, JPX, FTX表達情況進行檢測分析。
　　實驗結(jié)果:

7、r>　　1.10株hESC系均具有典型的hESC克隆形態(tài)，表達hESC細胞表面抗原SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81。
　　2.核型分析，9株為正常核型的女性hESCs,1株為正常核型的男性hESC。
　　3.9株女性hESC細胞HUMARA位點均為雜合子。
　　4.對9株HUMARA位點雜合子的hESC進行XCI傾斜性失活分析，4株為傾斜性失活，5株為隨機失活。
　　5.通過對9株h

8、ESCs全基因組行基因芯片檢測，發(fā)現(xiàn) hESC基因組存在CNV及LOH。通過軟件分析發(fā)現(xiàn)，本研究的9株hESC在1,4,9,10,12,13,15,17,18,20,21,22這12個染色體上未發(fā)現(xiàn)大于400kb的CNV存在。
　　6. X染色體傾斜性失活組hESC與隨機失活組CNV數(shù)量及大小合計無統(tǒng)計學差異。
　　7. X染色體傾斜性失活組hESC基因組的CNV涉及的基因有：KDM6A，F(xiàn)UNDC1,DUSP21,GAMT

9、。
　　8. X染色體傾斜性失活組hESC基因組的LOH涉及的基因有:HDAC8,XIST,TSIX,JPX, FTX。
　　9. X染色體傾斜性失活的2株hESCs XIST表達比隨機失活組高，JPX表達比隨機失活組更少，其他2個lncRNA即TSIX,FTX表達在兩組之間未見明顯差異。
　　10.hESC基因組的LOH區(qū)域涉及很多miRNA。
　　研究結(jié)論:
　　1.微陣列單核苷酸多態(tài)性技術(shù)是研究 hE

10、SC全基因組穩(wěn)定性的一個高敏感技術(shù),hESC基因組并不穩(wěn)定，存在CNVs和LOH。
　　2.利用HUMARA的甲基化特異性PCR是研究hESC X染色體失活狀態(tài)的一個經(jīng)典方法，hESC確實存在傾斜性失活情況。
　　3.hESC X染色體傾斜性失活與基因組CNV的數(shù)量、總的變異大小及染色體分布無關(guān)，而可能與CNV涉及的基因KDM6A，F(xiàn)UNDC1, DUSP21, GAMT有關(guān)。lncRNA如XIST的LOH可能誘發(fā)X染色體傾