1、研究背景：
　　 非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)預(yù)后差,5年生存率低于15％,其原因在于NSCLC極易發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)和遠處器官轉(zhuǎn)移。近年的研究表明,腫瘤微環(huán)境中的炎癥浸潤和脈管形成是腫瘤惡性進展的重要因素。白介素-17(IL-17)是新近發(fā)現(xiàn)的一類前炎癥因子,分泌IL-17的CD4+T細胞稱為Th17(interleukin17-producing T helper cells

2、)細胞,在腫瘤微環(huán)境中起決定免疫效應(yīng)方向的重要作用。目前越來越多的證據(jù)表明IL-17陽性細胞存在于多種炎癥相關(guān)性腫瘤中,包括前列腺癌、結(jié)直腸癌、肝細胞癌、乳腺癌、卵巢癌和NSCLC。不少實驗證明IL-17可促進腫瘤血管生成,并在人原位卵巢癌、肝癌和NSCLC中發(fā)現(xiàn)IL-17與血管密度相關(guān)。然而,也有一些實驗表明IL-17可促進免疫系統(tǒng)介導的抗腫瘤反應(yīng)。因此,關(guān)于IL-17在NSCLC預(yù)后中的作用仍不甚清楚;IL-17雖然被證明可促進腫瘤

3、血管生成,但其與另一脈管形成過程--淋巴管生成的關(guān)系卻少有研究。
　　 進一步研究表明,IL-17的胞內(nèi)信號通路與IL-1和Toll樣受體相似,而IL-1β可以促進靶細胞內(nèi)VEGF-C的表達:另一方面,IL-17可以促進靶細胞分泌IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1β和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等細胞因子。因此,我們有理由進一步推測:IL-17可能通過促進NSCLC細胞分泌VEGF-C加強淋巴管生成,從而

4、促進腫瘤的惡性進展。
　　 目的：
　　 闡明IL-17對NSCLC淋巴管生成及其預(yù)后的影響,探討其具體機制。
　　 方法
　　 1.應(yīng)用連續(xù)切片觀察IL-17與CD4、CD8(T細胞表面標志)、CD68(巨噬細胞表面標志)的共表達,以鑒定IL-17的細胞來源。免疫組織化學法檢測IL-17蛋白在52例NSCLC組織中的表達,并分析IL-17表達與腫瘤臨床病理特征、淋巴管生成及預(yù)后的關(guān)系。
　　 2

5、.免疫組織化學法檢測IL-17、VEGF-C、淋巴管密度(lymphatic vessel density,IND)在36例NSCLC組織中的表達,卡方檢驗和T檢驗分析IL-17、VEGF-C與LVD之間的相關(guān)關(guān)系。
　　 3.MTT實驗檢測IL-17對淋巴管內(nèi)皮(lymphatic endothelial cells,LECs)細胞生長的影響,Transwell實驗和管樣結(jié)構(gòu)形成實驗分析IL-17作用于Lewis肺癌細胞(le

6、wis lungcarcinoma cell,LLC)的條件培養(yǎng)基對LEC細胞遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成的影響。流式細胞儀技術(shù)檢測LLC和LEC的IL-17R的表達。
　　 4.以Lewis肺癌細胞(LLC)為主要體外模型,應(yīng)用定量RT-PCR和ELISA方法檢測IL-17刺激LLC表達VEGF-C mRNA和蛋白的時間和劑量效應(yīng)關(guān)系。Westernblotting檢測IL-17刺激A549細胞表達p-ERK1/2的情況,用p-ERK1

7、/2特異性阻斷劑PD98059阻斷p-ERK1/2的激活,觀察IL-17上調(diào)VEGF-C表達是否受到抑制,明確p-ERK1/2 MAPK信號通路在調(diào)控IL-17介導的VEGF-C上調(diào)表達中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.52例NSCLC患者的組織切片免疫組化染色發(fā)現(xiàn),25例NSCLC組織表達IL-17(25/52,48.1％)。大部分IL-17陽性細胞表現(xiàn)出典型的T細胞和中性粒細胞的形態(tài)特征;CD4、CD8陽性細胞部分

8、與IL-17陽性細胞位置一致。IL-17與腫瘤生物學的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):IL-17表達陽性的患者表現(xiàn)出腫瘤進展的臨床病理特征;高表達IL-17狀態(tài)與吸煙狀態(tài)和TNM分期相關(guān),而與年齡、性別、分化程度和病理學分型無關(guān);IL-17陽性表達患者的無病生存期(disease free survival,DFS)和總生存期(overall survival,OS)顯著低于IL-17陰性表達的患者,提示IL-17表達與患者預(yù)后差相關(guān)。單因素和多因素分

9、析進一步表明,腫瘤內(nèi)的IL-17的表達是DFS和OS的獨立預(yù)后因子。
　　 2.檢測36例NSCLC石蠟切片內(nèi)LND、VEGF-C表達與瘤內(nèi)IL-17表達的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)IL-17陽性表達患者的IND(11.1±5.3)高于IL-17陰性患者(5.8±4.2)(P＜0.01);IL-17表達與VEGF-C的表達具有相關(guān)性(P＜0.01)。
　　 3.IL-17對淋巴管內(nèi)皮細胞(LEC)的增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成沒有直接作用;

10、但是相對于LLC培養(yǎng)上清,LLC/IL-17條件培養(yǎng)基可以促進LEC的遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成(P＜0.05)。
　　 4.外源性IL-17可顯著增加LLC細胞VEGF-C的表達。LLC細胞經(jīng)用不同濃度的IL-17作用3h,VEGF-C mRNA表達呈劑量依賴性增加,其表達在IL-17濃度為10,100ng/ml時與對照組之間的差異均有統(tǒng)計學意義,并在IL-17濃度為10ng/ml時達到峰值,為對照組的1.40±0.17倍(P＜0.0

11、5)。LLC細胞經(jīng)用10ng/ml的IL-17作用48h,VEGF-C蛋白表達量與對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義(203.0±13.1 vs277.3±14.0,P＜0.05)。A549細胞用IL-17刺激后,可見VEGF-C表達上調(diào)和p-ERK1/2激活,提前給予p-ERK1/2特異性抑制劑PD98059可抑制IL-17介導的VEGF-C表達上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.人NSCLC組織中IL-17的表達是肺癌預(yù)后的獨

12、立危險因子,其IL-17主要來源于T細胞和中性粒細胞。
　　 2.IL-17與人肺癌組織IND和VEGF-C表達成正相關(guān),可能通過促進VEGF-C表達促進了淋巴管生成。
　　 3.IL-17對LEC的增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成沒有直接的促進作用,但IL-17作用于LLC細胞之后的上清可以促進LEC的遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成,這與LEC上不表達IL-17R但LLC表達IL-17R.有關(guān),提示IL-17可通過對NSCLC細胞的作用而