1、觀察端粒酶特異性抑制劑疊氮胸苷(3’-azido-23’-dideoxythymidine，AZT)對人TJ905 膠質母細胞瘤細胞系(TJ905細胞)端粒酶活性的抑制作用，以及抑制端粒酶活性后對TJ905細胞增殖和凋亡的影響。檢測抑制端粒酶活性能否上調TJ905細胞抑癌基因生長抑制因子1 (Ihibitor ofgrowth 1，ING1)的表達，分析TJ905細胞的ING1基因表達變化與其增殖活性和凋亡程度的相互關系。旨在探討抑制端

2、粒酶活性后對惡性膠質瘤細胞增殖和凋亡影響的下游作用機制；了解ING1 基因編碼產物p33<'INGIb>在該機制中的作用和作用地位；評價AZT治療惡性膠質瘤的效果和應用前景。最終目的是進一步加深對惡性膠質瘤發(fā)生、發(fā)展機制的認識，為以端粒酶為靶點進行惡性膠質瘤化學藥物靶向治療的可行性提供客觀的實驗依據。 方法:將TJ905 細胞按1～5×10<'5>/ml接種于75cm<'2>培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至對數生長期，隨機分為四組：對照組、AZT

3、 50μM組、AZT 100μM組、AZT 200μM組。常規(guī)傳代培養(yǎng)，取第一、三、六代進行以下檢測：以端粒重復擴增法(telomericrepeatamplification proteocol，TRAP)檢測經不同濃度AZT作用后TJ905細胞端粒酶活性的變化；以細胞集落形成實驗評價AZT對TJ905細胞增殖活性及生長速度的影響；通過：Ki-67和GFAP表達的免疫細胞化學檢測，觀察AZT抑制TJ905細胞增殖和誘導其衰老凋亡的作用

4、；以流式細胞術(FCM)、單細胞凝膠電泳分析法(single cell gel electrop horesis assay，SCGE)和TUNEL 法，檢測不同濃度AZT 對TJ905 細胞凋亡和細胞周期的影響；采用逆轉錄PCR(reverse transcriptPCR，RT-PCR) 方法檢測用不同濃度AZT作用后，TJ905 細胞p33<'INGlb> mRNA的表達變化。 結果：端粒酶活性檢測結果顯示，各用藥組端粒酶

5、活性均明顯低于對照組，AZT200μM 組端粒酶活性下降最明顯。說明 AZT 能有效的抑制 TJ905細胞的端粒酶活性，其抑制作用呈現劑量依賴性。 細胞集落形成實驗結果證實，三個用藥組TJ905細胞的克隆形成率均低于對照組(P<0.01)，AZT200μM組的克隆形成率低于AZT 50μM 組及AZT 100μM 組(P<0.01)，差異均有顯著性。免疫細胞化學檢測結果顯示，各用藥組第六代TJ905細胞的Ki-67陽性細胞標記指

6、數均明顯低于第一代(P<0.01)，而各用藥組第六代TJ905細胞的GFAP陽性細胞標記指數均明顯高于第一代(P<0.01)，差異均有顯著性。以上結果說明AZT可通過抑制TJ905細胞的端粒酶活性，有效的抑制其增殖活性和誘導其成熟分化。 單細胞凝膠電泳檢測結果顯示，各用藥組TJ905細胞在第一代時彗星拖尾細胞(凋亡細胞)的數量即有增加，凋亡指數(AI％)高于對照組，有顯著性差異(P<0.01)；在第六代時DNA切割進一步加重，凋

7、亡細胞彗星拖尾的尾矩明顯延長。TUNEL檢測結果顯示，各用藥組TJ905細胞在第一代時凋亡指數與對照組相比即增加，并有顯著性差異(P<0.01)；傳代培養(yǎng)至第六代時，各用藥組的凋亡指數均較第一代升高，且第六代的AZT 200μM組及AZT 100μM組的凋亡指數均高于AZT 50μM 組，差異有顯著性(P<0.01)，與單細胞凝膠電泳檢測結果趨勢相同。流式細胞分析顯示，各用藥組的TJ905細胞在第一代即可出現凋亡峰，但凋亡率比較低；傳代

8、培養(yǎng)至第六代時再次出現明顯的凋亡峰，凋亡率達29％。以上結果說明AZT可通過抑制TJ905細胞的端粒酶活性，有效的誘導其凋亡。盡管在二～五代未見明顯的凋亡峰，但細胞周期的分布發(fā)生了改變，與對照組相比較，各用藥組TJ905細胞的G0/G1期細胞比例增多，S期細胞比例減少，說明在此期間AZT還可通過阻滯TJ905細胞由G0/G1向S期過渡抑制其增殖。 經RT-PCR檢測發(fā)現，各用藥組TJ905細胞P33<'INGlb> mRNA 的

9、相對灰度值均高于對照組，并隨用藥濃度增加和作用時間延長而相應增高，各組之間以及同一濃度不同代數之間的比較均有顯著差異(P<0.01)。經直線相關分析證實，第六代中各組P33<'INGlb> mRNA相對灰度值與克隆形成率和Ki-67 LI％呈顯著負相關 (r=-0.994～0.990，p<0.01)與原位細胞凋亡標記的和單細胞彗星電泳檢測的AI％呈顯著正相關(r=0.996～0.999，p<0.01)。說明AZT通過抑制端粒酶活性能上調

10、P33<'INGlb>bmRNA的表達水平從而發(fā)揮其抑制細胞增殖和誘導細胞衰老和凋亡作用。 結論： 1．端粒酶異常再活化是惡性膠質瘤細胞無限增殖和凋亡抑制的根本原因，端粒酶抑制劑 AZT 能有效的抑制人膠質母細胞瘤細胞系(TJ905 細胞)的端粒酶活性，其抑制作用呈劑量依賴性關系。 2．抑制TJ905細胞的端粒酶活性后，能上調該細胞系的P33<'INGlb>(抑癌基因ING1 的編碼產物) 表達，其表達水平與AZ

11、T用藥濃度成正比。 3．抑制TJ905細胞的端粒酶活性后，可阻滯腫瘤細胞由G0/G1向S期過渡，有效的抑制了該細胞系的增殖活性，并誘導其成熟分化和衰老凋亡。 4．各用藥組的p33<'INGlb>表達水平隨AZT用藥濃度增加而依次遞增，與腫瘤細胞的克隆形成率及Ki-67標記指數呈負相關，與腫瘤細胞的凋亡標記指數呈正相關。 5．以上結果說明，端粒酶再活化可通過直接或間接抑制P33<'INGlb>表達，促進惡性膠質瘤細