1、宮頸癌是威脅女性生命的首位生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來，隨著宮頸癌篩查的有效開展，世界范圍內(nèi)宮頸癌的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)大幅下降，而宮頸癌前病變即宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervicalintraepithelialneoplasia，CIN)的檢出率卻越來越高。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中存在較長的、可逆轉(zhuǎn)的癌前病變期，包括宮頸不典型增生和宮頸原位癌，它反映宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的連續(xù)過程。宮頸上皮不典型增生表現(xiàn)為宮頸上皮層內(nèi)出現(xiàn)異型細胞，即細胞大小不

2、一，形狀不規(guī)則，細胞核增大濃染，核漿比例增大，核分裂象增多，甚至有病理性核分裂，細胞極性紊亂等。根據(jù)細胞異常的程度及上皮累積范圍又可將CIN分為三級，即CIN1級（輕度不典型增生），Ⅱ級（中度不典型增生）和Ⅲ級（重度不典型增生和原位癌）。根據(jù)對CIN的自然病史的研究，絕大多數(shù)的低級別CIN（即CINⅠ）會自然消退，只有0.3％-1％會發(fā)展為浸潤癌，而未經(jīng)治療的高級別CIN(即CINⅡ和CINⅢ)中20％-45％將發(fā)展為原位癌或浸潤癌，故

3、高級別CIN為潛在的宮頸癌前病變。由于CIN發(fā)展形成宮頸浸潤癌的病程較長大約10年，因此，對CIN的患者及時早期發(fā)現(xiàn)、積極有效治療是降低宮頸癌發(fā)病率的關(guān)鍵。目前認為人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)感染是CIN和宮頸癌發(fā)生的始動因素，在99％以上的宮頸癌及CIN中存在HPVDNA。HPV可分為高危型和低危型兩大類，低危型多導(dǎo)致疣類病變和CIN1，而高危型則多導(dǎo)致CIN2-3及宮頸癌的發(fā)生。但是HPV不能進行常

4、規(guī)的體外培養(yǎng)，而高危型HPV引起的疾病是一個漫長的過程。因此，對攜帶HPV的宮頸上皮內(nèi)瘤變細胞進行原代培養(yǎng)并對其生物學(xué)特性進行研究，有利于更好的了解HPV感染宮頸上皮細胞的重要的意義，為高級別CIN和宮頸癌的進一步研究提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
　　目前，正常宮頸上皮細胞(Normaluterinecervix，NUC)及宮頸癌細胞的原代培養(yǎng)國內(nèi)外已屢見報道，但是對于高級別CIN細胞這一潛在癌前病變的培養(yǎng)及其的生物學(xué)特性的研究國內(nèi)外

5、鮮有報道。眾所周知，癌細胞的生物學(xué)特性主要包括:①形態(tài)特征:細胞異型性如癌細胞大小形態(tài)不一，核質(zhì)比顯著高于正常細胞;核形態(tài)不一，并可出現(xiàn)巨核、雙核或多核現(xiàn)象;核分裂像常增多。②生理生化特征:細胞接觸抑制喪失;具有遷移性和侵襲性等。但是，對于高級別CIN這一癌前期病變細胞卻僅從形態(tài)學(xué)特征方面進行了描述，對于其生理生化特征卻未見報道。單從宮頸癌細胞和高級別CIN細胞的形態(tài)特征來看，二者均具有異型性，故很難從形態(tài)學(xué)上對二者進行區(qū)分。但是癌細胞

6、增殖活性強，具有非接觸性抑制、遷移性及侵襲性，與人類腫瘤侵襲有關(guān)的MMP-2亦明顯升高。高級別CIN細胞是否亦具有上述特性？高級別CIN細胞為何可以局限于上皮內(nèi)多年或消失而不發(fā)生轉(zhuǎn)移？基于此，本項目擬對高級別CIN細胞進行原代培養(yǎng)，探索一種快速、簡便、有效的培養(yǎng)方法，同時對其生物學(xué)特性進行體外研究，為宮頸癌及其癌前病變的進一步研究提供理論及實驗依據(jù)。
　　第一部分:一種新的正常人宮頸上皮細胞原代培養(yǎng)技術(shù)的建立
　　研究目的:

7、
　　1.提供一種新型培養(yǎng)基，既能促進細胞的貼壁，又能減少成纖維細胞的污染。
　　2.從培養(yǎng)器皿方面，探索一種能協(xié)同促進宮頸上皮細胞貼壁的方法。
　　3.探索一種高純度的宮頸上皮細胞的體外培養(yǎng)的方法。
　　研究方法:
　　1.取人正常宮頸上皮組織，用Ⅰ型膠原酶消化分解后得到宮頸上皮細胞懸液。
　　2.將細胞分別接種到以下培養(yǎng)瓶中:①未經(jīng)鼠尾膠原包被，僅含無血清培養(yǎng)基(keratinocyteserum

8、-freemedium，K-SFM);②未經(jīng)鼠尾膠原包被，含5％胎牛血清的K-SFM;③用鼠尾膠原包被，僅含K-SFM;④用鼠尾膠原包被，含5％胎牛血清的K-SFM。
　　3.待細胞貼壁后，首次換液，將培養(yǎng)基全部換成K-SFM。
　　4.采用細胞免疫熒光檢測宮頸上皮基層角蛋白(Keratin，K)5、K14和K19的表達。
　　結(jié)果:
　　1.在含5％胎牛血清的培養(yǎng)基中，細胞的貼壁速度較無血清的培養(yǎng)基快（約30％

9、和10％）。
　　2.用鼠尾膠原Ⅰ型包被的培養(yǎng)瓶中，細胞的貼壁速度較未經(jīng)鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中快（約60％和30％）。
　　3.聯(lián)合使用含5％胎牛血清的培養(yǎng)基和經(jīng)鼠尾膠原Ⅰ型包被的培養(yǎng)瓶是最理想的培養(yǎng)宮頸上皮細胞的方法。
　　4.K5，K14和K19幾乎在所有細胞的細胞漿中均呈陽性表達，但K5表達很弱。
　　結(jié)論:
　　1.低濃度胎牛血清可以提高上皮細胞的貼壁能力，而無血清培養(yǎng)基抑制成纖維細胞的生長。

10、>　　2.聯(lián)合使用5％胎牛血清的培養(yǎng)基和經(jīng)鼠尾膠原Ⅰ型包被的培養(yǎng)瓶是一種新穎、簡便、有效的人宮頸上皮細胞的培養(yǎng)方法。
　　3.我們的方法可以從成人宮頸上皮組織中快速得到大量高純度的正常宮頸上皮細胞。
　　第二部分:人高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變細胞的原代培養(yǎng)和鑒定
　　研究目的:
　　建立一種人小塊宮頸瘤變組織來源的自然感染HPV的高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變細胞的體外培養(yǎng)方法;為高級別上皮內(nèi)瘤變細胞生物學(xué)特性的研究提供實驗基礎(chǔ)

11、。
　　研究方法:
　　1.取小塊人宮頸瘤變組織，取出一小部分行HPVDNA分型檢測。
　　2.將剩余瘤變組織用Ⅰ型膠原酶消化分解后制成類細胞懸液（未經(jīng)細胞篩過濾）。
　　3.將類細胞懸液接種到含5％胎牛血清+K-SFM的、經(jīng)鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中。
　　4.一組細胞培養(yǎng)3天后首次換液并更換K-SFM，收集未貼壁細胞并重新種植到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)3天。另一組細胞培養(yǎng)6天后首次換液并更換K-SFM。

12、　　5.將第三代細胞收集后行HPVDNA分型檢測。
　　6.通過細胞免疫熒光檢測宮頸上皮基底層K14和K19，宮頸干細胞K17和P63的表達，對CIN細胞進行鑒定。
　　結(jié)果:
　　1.細胞培養(yǎng)的第1、3和6天，分別有30％、60％和80％的高級別CIN細胞貼壁，未貼壁細胞在第3天重新收集并繼續(xù)培養(yǎng)3天后仍然有30％的細胞貼壁，但由于細胞密度較低很難長滿培養(yǎng)瓶并傳代。
　　2.傳代后高級別CIN細胞仍然保持其大小

13、不等、形狀異常的形態(tài)，沒有明顯分化現(xiàn)象。
　　3.傳代后高級別CIN細胞的HPV分型檢測結(jié)果同原代一致。
　　4.K14和K19幾乎在所有NUC細胞和高級別CIN細胞的胞漿中表達;但是，K17和P63僅在高級別CIN細胞的胞漿中表達。
　　結(jié)論:
　　1.我們將“組織塊培養(yǎng)法”與“酶消化法”相結(jié)合制備了類細胞懸液，不僅克服了“組織塊培養(yǎng)法”中細胞因移動受到限制而造成的生長緩慢，而且節(jié)省細胞過濾過程中丟失的細胞，獲

14、得了更多的CIN細胞，克服了CIN培養(yǎng)過程中因標本過小而造成的困難。
　　2.高級別CIN細胞培養(yǎng)的第6天可作為最佳首次換液時間。
　　3.我們建立了一種從小塊宮頸瘤變組織獲取自然攜帶HPV的高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變細胞的簡單而實用的培養(yǎng)方法，為CIN病變的體外研究提供了實驗基礎(chǔ)。
　　第三部分:人高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變細胞生物學(xué)特性的體外研究
　　研究目的:
　　通過與NUC細胞及宮頸癌Caski細胞的對比，觀

15、察人高級別CIN細胞的生物學(xué)行為如生長增殖能力、腫瘤標志物的表達及遷徙和侵襲能力等，探討高級別CIN細胞的生物學(xué)特性，為宮頸癌前病變及宮頸癌的進一步研究及治療提供理論及實驗依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.應(yīng)用MTT實驗測定高級別CIN細胞及對照組NUC細胞和宮頸癌Caski細胞的生長曲線。
　　2.應(yīng)用細胞接觸抑制試驗檢測高級別CIN細胞的生長活性。當(dāng)細胞生長到約80％～90％融合時，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，觀察細胞有無接觸

16、性抑制現(xiàn)象。
　　3.應(yīng)用流式細胞技術(shù)，檢測高級別CIN細胞及對照組NUC細胞和Caski細胞的生長周期。
　　4.應(yīng)用DNA倍體分析技術(shù)，檢測高級別CIN細胞及對照組NUC細胞和Caski細胞的異倍體比例。
　　5.采用細胞免疫熒光技術(shù)，檢測高級別CIN細胞及其對照組NUC細胞和Caski細胞中腫瘤標志物Ki-67和p16的表達情況。
　　6.在酶聯(lián)免疫分析實驗中，應(yīng)用競爭性抑制法測定高級別CIN細胞及其對照組

17、NUC細胞和Caski細胞分泌性及細胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrixmetalloproteinase2，MMP-2)水平;應(yīng)用雙抗體夾心法測定基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2(Tissueinhibitorsofmetalloproteinase2,TIMP-2)的水平。
　　7.應(yīng)用Transwell小室技術(shù)，檢測高級別CIN細胞及其對照組NUC細胞和Caski細胞的遷移和侵襲能力。
　　8.SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行

18、分析:生長曲線用重復(fù)測量資料的方差分析;計量資料統(tǒng)計結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，三組之間的差異比較采用方差分析。
　　結(jié)果:
　　1.高級別CIN細胞、NUC細胞和宮頸癌Caski細胞的生長速度明顯不同(P＜0.01)，Caski細胞的生長速度明顯快于高級別CIN細胞和NUC細胞(P＜0.01)，高級別CIN細胞的生長速度明顯快于NUC細胞(P＜0.01)。高級別CIN細胞生長曲線的延緩期明顯縮短，Caski細胞的生長曲線沒有明

19、顯的延緩期。
　　2.高級別CIN細胞貼壁生長匯合成單層后即停止生長，存在接觸抑制現(xiàn)象;Caski細胞貼壁生長匯合成單層后繼續(xù)生長，接觸抑制現(xiàn)象消失。
　　3.細胞周期檢測實驗顯示S期細胞比率(SPF):Caski細胞組＞高級別CIN細胞組＞NUC細胞組(P＜0.01)。
　　4.DNA倍體分析實驗中，高級別CIN細胞組和Caski細胞組異倍體細胞所占比例均明顯高于NUC細胞組(P＜0.01)，但高級別CIN細胞組和C

20、aski細胞組之間異倍體細胞所占比例無顯著性差異(P=0.392)。
　　5.細胞免疫熒光顯示，在幾乎所有NUC細胞、高級別CIN細胞和Caski細胞的細胞核中，均可見Ki-67呈彌漫的強陽性染色。p16在NUC細胞、高級別CIN細胞和Caski細胞的細胞核和細胞漿中均呈陽性表達。
　　6.Caski細胞組分泌性MMP-2的含量明顯高于NUC細胞組和高級別CIN細胞組(P＜0.05)，NUC細胞組與高級別CIN細胞組之間無顯

21、著性差異(P＞0.05)，三組細胞之間細胞內(nèi)MMP-2的含量無顯著性差異(P＞0.05);三組細胞之間分泌性和細胞內(nèi)TIMP-2的含量及MMP-2/TIMP-2的比值無顯著性差異(P＞0.05)。
　　7.Transwell體外遷移和侵襲實驗均表明:高級別CIN細胞的遷移能力明顯優(yōu)于NUC細胞，但顯著低于Caski細胞(P＜0.01);高級別CIN細胞有侵襲能力，但明顯低于Caski細胞(P＜0.001)，NUC細胞無明顯侵襲能力

22、。
　　結(jié)論:
　　1.高級別CIN細胞的生長活力較NUC細胞明顯增強，但仍然具有接觸抑制現(xiàn)象。
　　2.高級別CIN細胞與宮頸癌Caski細胞在增殖的過程中均出現(xiàn)了大量的異倍體細胞，說明高級別CIN細胞的增殖能力較強;細胞周期中S期細胞比率的升高，進一步說明了高級別CIN細胞具有較強的生長活力。
　　3.腫瘤標志物Ki-67和p16在NUC細胞、高級別CIN細胞和Caski細胞均呈陽性表達，說明它們可能僅僅是細