1、研究背景和目的： 異基因造血干細胞移植(allo—HSCT)是目前治療各種造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)腫瘤、再生障礙性貧血、自身免疫性疾病和某些遺傳性疾病的主要和有效手段。移植物抗宿主病(GVHD)和移植后免疫重建延遲導致的感染、腫瘤復發(fā)以及第二腫瘤發(fā)生是allo—HSCT后的主要并發(fā)癥和致死原因。因此，降低移植后GVHD發(fā)生率、減輕GVHD嚴重程度和加速移植后免疫系統(tǒng)重建是提高患者移植后長期生存率和生存質(zhì)量的重要方法和手段。

2、目前，減輕移植后胸腺上皮細胞(TECs)損傷和胸腺輸出功能破壞的相關因素有性激素抑制劑、角質(zhì)化細胞生長因子、生長激素、白介素—7(IL—7)和調(diào)節(jié)性T細胞等。性激素導致胸腺損傷的機理目前仍不清楚，可能與胸腺基質(zhì)上的性激素受體有關，利用性腺摘除或藥物去勢方法降低性激素水平能逆轉(zhuǎn)胸腺損傷，在恢復移植后胸腺對T細胞的修飾功能和輸出功能的同時不會加重GVHD和減輕移植物抗白血病(GVL)效應。Marchetti和Heng等報道能抑制性激素的促性

3、腺激素釋放激素(LHRH)作為藥物去勢，能促進移植后胸腺功能的恢復，從而促進免疫重建。 本文通過構建C57BL/6→BALB/c小鼠HLA不相合allo—HSCT模型和性激素抑制劑處理的小鼠allo—HSCT模型；對小鼠胸腺行胸腺細胞內(nèi)INFγ、TNFα和IL-1β細胞因子水平檢測；利用實時定量PCR(FAM熒光探針法)分析小鼠外周血T細胞的siTRECs水平，探討aGVHD對胸腺功能的影響，并評價LHRH對allo—HSCT后

4、胸腺功能的保護作用。 研究方法： 1、構建C57BL/6→BALB/c小鼠allo—HSCT模型 2、構建雌激素抑制劑LHRH處理的去勢BALB/c小鼠allo—HSCT模型 3、構建BALB/c→BALB/c小鼠auto—HSCT模型 4、實驗分組；實驗分5組，分別為allo—HSCT小鼠組(A組)，LHRH處理的allo—HSCT小鼠組(B組)，auto—HSCT小鼠組(C組)，正常BALB/

5、c雌性小鼠組(D組)和正常C57BL/6雄性小鼠組(E組)，D組和E組為正常對照組。 5、造血重建標準：外周血白細胞計數(shù)(WBC)>1.0×109/L為造血重建指標，并通過嵌合體檢測證實骨髓植入成功。 6、嵌合體檢測：PCR擴增外周血基因組Y染色體基因。 7、aGVHD表現(xiàn)與評分標準：aGVHD判斷通過觀察：體重變化、食欲、精神狀態(tài)，活動能力，皮膚黏膜，腹瀉等情況，在移植后+14d，根據(jù)體重減輕、姿態(tài)、活動能力、

6、毛發(fā)和皮膚對每只小鼠進行aGVHD評分，并結(jié)合皮膚、肝臟aGVHD病理表現(xiàn)評價aGVHD嚴重程度。 8、胸腺細胞內(nèi)細胞因子INFγ、TNFα和IL-1β的檢測：采用蛋白液相測定方法進行檢測。 9、胸腺功能測定：采用熒光定量PCR(FAM熒光探針法)測定外周血sjTRECs水平。 10、統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行處理。結(jié)果用均數(shù)±標準差(—X±SD)表示，兩組間比較采用indepen

7、dentT—test進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用One—wayANOVA進行統(tǒng)計分析，組間比較采用LSD多重比較法。隨時間變化的變量比較采用重復測量統(tǒng)計分析。一個因變量與多個自變量間的線性數(shù)量關系用linearregression進行統(tǒng)計分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 討論： Allo—HSCT后T細胞免疫重建延遲引起的感染、腫瘤復發(fā)和第二腫瘤是影響移植療效的重要原因之一，而胸腺作為主要的免疫器官，其結(jié)構損傷和功

8、能低下是引起T細胞免疫重建延遲的最主要因素。因此，探討allo—HSCT后胸腺損傷的機理、預防和減輕胸腺損傷的方法以及促進胸腺功能恢復的途徑對重建allo—HSCT后完善的免疫功能具有十分重要的意義。 在allo—HSCT中，放療、化療和aGVHD等因素均可以損傷宿主胸腺微環(huán)境，破壞胸腺對移植后T細胞的修飾和輸出功能，影響T細胞重建，從而增加allo—HSCT后宿主感染發(fā)生、腫瘤復發(fā)以及第二腫瘤發(fā)生率。有報道指出，GVHD是導致

9、allo—HSCT后胸腺損傷的主要原因。在GVHD患者中，供者T細胞通過釋放各種細胞因子如INFγ和TNFα等對胸腺組織進行損傷，并誘導胸腺細胞凋亡，從而破壞移植后胸腺功能。因此，如何減輕移植后胸腺損傷和功能破壞對于促進移植后免疫重建有重要意義。在手術切除性腺的小鼠移植模型中觀察到性腺摘除能逆轉(zhuǎn)GVHD對胸腺損傷，恢復移植后胸腺對T細胞的修飾功能和輸出功能。Marchetti和Heng等最近報道LHRH作為藥物去勢，也能促進移植后胸腺功

10、能的恢復，從而促進免疫重建。本研究構建C57BL/6→BALB/c小鼠HLA不相合allo—HSCT模型、LHRH處理的aGVHD小鼠模型及非GVHD小鼠模型。比較發(fā)生aGVHD的小鼠和非GVHD小鼠細胞因子得出：aGVHD的小鼠胸腺細胞內(nèi)細胞因子INFγ、TNFα和IL-1β水平明顯高于非GVHD小鼠。且aGVHD評分越高，INFγ水平也越高。這些提示INFγ、TNFα和IL-1β可能參與了aGVHD對胸腺的損傷過程。另外，我們在移植

11、前采用LHRH藥物去勢的方法對小鼠胸腺進行保護，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非LHRH處理的aGVHD小鼠GVHD評分明顯高于LHRH處理的小鼠，且非LHRH處理的aGVHD小鼠的胸腺細胞內(nèi)INFγ、TNFα和IL-1β細胞因子水平明顯高于LHRH處理小鼠。這些結(jié)果表明，藥物去勢能減輕胸腺損傷的同時通過保護胸腺而減輕移植后aGVHD的嚴重程度。但性激素抑制劑減輕GVHD損傷胸腺的機理仍有待進一步探討。 結(jié)論： 1、成功構建了C57BL/6→

12、BALB/c小鼠allo—HSCT模型、性激素抑制劑LHRH處理的去勢BALB/c小鼠allo—HSCT模型和BALB/c→BALB/c小鼠auto—HSCT模型。 2、aGVHD是移植后胸腺損傷的原因之一，細胞因子INFγ、TNFα和IL-1β可能參與了aGVHD對胸腺的損傷過程。 3、LHRH藥物去勢能降低胸腺細胞內(nèi)細胞因子INFγ、TNFα和IL-1β水平，減輕GVHD對胸腺的損傷。 4、LHRH藥物去勢通