1、第一部分外源性VEGF對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549體外藥物敏感性的影響
　　 目的考察外源性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)體外培養(yǎng)的A549肺癌細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，化療藥物敏感性的影響，并觀察VEGF-VEGFR2-PI3K/Akt信號(hào)通路在其中的作用。從而初步探討VEGF對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)影響及機(jī)制。
　　 方法分別在含有10％、0.5％、0％血清濃度的培養(yǎng)基中，加入不同濃度梯度外源性VEGF培養(yǎng)A549細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF對(duì)于細(xì)胞

2、生長(zhǎng)及生存的影響；確定順鉑、吉西他濱、多烯紫杉醇的適合作用濃度，MTT法比較加入與否外源性VEGF時(shí)A549細(xì)胞對(duì)上述化療藥物的敏感性；MTT法比較加入外源性VEGF時(shí)抑制VEGF-VEGFR2-PI3K/Akt信號(hào)通路與否對(duì)于A549細(xì)胞的藥物敏感性的影響；Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加入VEGF時(shí)細(xì)胞VEGF-VEGFR2-PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt蛋白磷酸化的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)VEGF+化療藥物組與單純化療組相比，細(xì)胞

3、周期及凋亡的變化情況。
　　 結(jié)果：1、向含10％及0.5％血清的培養(yǎng)基中加入不同濃度梯度外源性VEGF，細(xì)胞的增殖及凋亡變化不顯著。應(yīng)用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞，MTT示分別加入50ng/ml，100ng/ml，500ng/m1外源性VEGF均能使促進(jìn)其增殖及生存，流式細(xì)胞分析示加入100ng/ml外源性VEGF細(xì)胞S期及G2期比例增加，G1期比例下降。2、MTT法示在0.5％血清的培養(yǎng)基中應(yīng)用適宜濃度的順鉑、吉西他濱

4、、多烯紫杉醇?xì)?xì)胞的同時(shí)加入外源性VEGF能夠顯著提高細(xì)胞生存，應(yīng)用VEGF-VEGFR2-PI3k/Akt信號(hào)通路的抑制劑能夠阻斷這種效應(yīng)，流式細(xì)胞分析示加入VEGF組與對(duì)照組相比化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯減少。3、Western-blot實(shí)驗(yàn)示外源性VEGF對(duì)細(xì)胞中Akt磷酸化的激活作用于30分鐘至2小時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，隨時(shí)間發(fā)展逐漸減弱，加入VEGF信號(hào)通路抑制劑能夠減弱VEGF對(duì)Akt磷酸化的激活作用。
　　 結(jié)論1、無(wú)血清培養(yǎng)

5、基培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，VEGF可延長(zhǎng)A549細(xì)胞的存活時(shí)間。2、向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入外源性VEGF可拮抗順鉑、吉西他濱、多烯紫杉醇對(duì)于A549細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡作用。3、VEGF拮抗A549細(xì)胞的凋亡作用與VEGF-VEGFR-PI3K/Akt通路相關(guān)。
　　 第二部分 RNAi聯(lián)合化療藥物對(duì)于肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549殺傷作用的研究
　　 目的探討由質(zhì)粒載體介導(dǎo)的針對(duì)VEGF的RNAi對(duì)A549肺癌細(xì)胞中VEGF的表達(dá)、A549細(xì)胞增殖的

6、影響及RNAi聯(lián)合化療藥物對(duì)腫瘤的殺傷作用，為RNA干擾技術(shù)在肺癌治療領(lǐng)域中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法將攜帶有針對(duì)VEGF的RNAi表達(dá)框架的真核表達(dá)載體pRS-VEGF-shRNA質(zhì)粒于DH5a大腸桿菌中擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序鑒定，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，RT-PCR法檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)被抑制情況，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清液中VEGF蛋白表達(dá)，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒對(duì)于A549細(xì)胞的增殖與凋亡的

7、影響，MTT法檢測(cè)RNAi與順鉑、吉西他濱或多烯紫杉醇共同作用時(shí)細(xì)胞的增殖與凋亡的變化。
　　 結(jié)果：1、質(zhì)粒pRS-VEGF-shRNA進(jìn)行擴(kuò)增后，測(cè)序結(jié)果顯示其具有能夠抑制VEGF表達(dá)的shRNA序列。2、RT-PCR法示與對(duì)照組比較，48小時(shí)后質(zhì)粒pRS-VEGF-shRNA轉(zhuǎn)染組VEGF mRNA表達(dá)量顯著降低。3、ELISA法示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清液中VEGF蛋白含量顯著降低，與RT-PCR結(jié)果相一致。4、轉(zhuǎn)染后48h，MT