1、血管內皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)是血管屏障的重要組成部分，可以合成和分泌多種生物活性物質，在調節(jié)血管收縮舒張功能、維持內環(huán)境穩(wěn)定等方面具有重要意義。VEC功能障礙是多種心血管疾病的發(fā)病基礎，也和呼吸、生殖、神經內分泌、腫瘤及風濕性疾病等密切相關。VEC功能障礙的評價方法主要包括循環(huán)內皮細胞檢測、內皮細胞分泌活性物質的測定、內皮細胞內鈣離子濃度和線粒體膜電位的測定、冠狀動脈內皮功能的檢測等方法，綜

2、合運用上述評價方法，有利于探討VEC功能障礙的發(fā)生機制。研究發(fā)現(xiàn)，在上述多種疾病的發(fā)生中，VEC既是受損的“靶”細胞，又是損傷的“激發(fā)”細胞，因此，從整體、細胞和分子水平進行VEC損傷及保護性研究是防治多種疾病的重點課題之一。 缺氧是導致VEC損傷的極為常見的病理因素，血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)直接作用于血管床使血

3、管收縮的重要的血管活性肽，Ang II是該系統(tǒng)中最為重要的血管活性物質，它行使著循環(huán)內分泌系統(tǒng)和組織旁分泌/自分泌系統(tǒng)的功能，Ang II可引起血管內皮功能低下。缺氧和Angll在高血壓、動脈硬化、心衰和肺動脈高壓等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。在現(xiàn)代航天航空活動中，因缺氧引起的航空事故及事故征候仍占有相當比例，因此，以加強內源性抗損傷的醫(yī)療思想為指導，將利用現(xiàn)代技術提取的副作用較少的植物提取物應用于缺氧損傷與保護作用的研究具有重要意

4、義。 目的：通過建立VEC缺氧損傷模型，應用激光共聚焦顯微鏡觀察缺氧條件下Ang II引起VEC鈣離子濃度及線粒體膜電位(mitochondria membrane potential，MMP)的變化，應用放射免疫法測定在缺氧和Ang II作用后VEC培養(yǎng)液中內皮素( endothelin，ET)含量的變化，并觀察銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)對上述變化的影響，探討GBE對VEC的保護作用機制

5、。 方法： 一、選用人大動脈血管內皮細胞，常規(guī)復蘇傳代，建立VEC缺氧損傷模型。 二、實驗設為空白對照組、缺氧組、缺氧+GBE保護組、Ang II作用組、Ang II+GBE保護組、缺氧+Ang II作用組及缺氧+Ang II+GBE保護組等七組。各組細胞分別在不同因素作用后，應用Fluo-3/AM負載，用激光共聚焦顯微鏡測定VEC內Fluo-3的熒光強度值以代表VEC內的Ca2+濃度；各組細胞分別在不同因素作用

6、后，應用Rhodamine123(Rh123)負載，用激光共聚焦顯微鏡測定VEC內Rh123的熒光強度值以代表VEC內的MMP。 三、將培養(yǎng)的VEC按每12孔一組分為上述七組，各組細胞分別在不同因素作用后，吸取VEC培養(yǎng)上清液，應用放射免疫技術，測定VEC培養(yǎng)上清液中的ET含量。 結果： 一、與對照組比較，經過缺氧作用后，VEC內Ca2+濃度明顯升高(P<0.01)，MMP明顯降低(P<0.01)，VEC培養(yǎng)上清

7、液中的ET含量明顯增加(P<0.001)。 二、與對照組比較，經過Ang II作用后，VEC內Ca2+濃度明顯升高(P<0.01)，MMP明顯降低(P<0.01)，VEC培養(yǎng)上清液中的ET含量明顯增加(P<0.001)。 三、與對照組比較，缺氧與Ang II聯(lián)合作用后，VEC內Ca2+濃度明顯升高(P<0.01)，MMP明顯降低(P<0.01)，VEC培養(yǎng)上清液中的ET含量明顯增加(P<0.001)，且比單純缺氧作用及單

8、純Ang II作用的影響顯著(P<0.05)。 四、與相應的損傷組比較，GBE保護組細胞內Ca2+濃度明顯降低(P<0.01)，MMP明顯升高(P<0.05)，VEC培養(yǎng)上清液中的ET含量明顯下降(P<0.001)。 五、與對照組比較，各GBE保護組細胞內Ca2+濃度、MMP以及VEC培養(yǎng)上清液中的ET含量均未恢復至對照組水平，差異有顯著意義(P<0.05)。 討論： 一、缺氧對VEC內Ca2+濃度、MM

9、P和培養(yǎng)上清液中ET含量的影響：Ca2+作為細胞內信使，參與各種調控細胞功能的信息轉導過程，Ca2+超載是許多原因引起細胞損害的“最后共同通路”。細胞內Ca2+濃度由ATP酶依賴性鈣泵、Na+/ Ca2+交換以及正常Ca2+通道調控。缺氧導致細胞氧化磷酸化功能抑制，細胞內ATP含量快速下降，鈉鉀泵功能障礙，導致細胞膜去極化而引起電壓依賴型Ca2+通道開放，Ca2+內流；同時，缺氧使氧自由基清除系統(tǒng)功能降低或喪失，而生成系統(tǒng)卻活性增強，氧

10、自由基大量產生與急劇“堆積”，作用于內質網(wǎng)、線粒體等鈣庫，促進Ca2+超載.細胞內Ca2+超載觸發(fā)線粒體膜通透性轉換孔(Mitochondrial permeability transition pore，MPT)的開放，導致MMP下降；缺氧促進機體活性氧生成，活性氧生成過多可直接或間接損傷線粒體膜，造成MMP下降。VEC內氧自由基含量的增加以及脂質過氧化作用增強，導致VEC分泌ET的功能增強。本實驗結果再次驗證了缺氧可導致VEC內Ca

11、2+濃度升高、MMP下降及VEC分泌ET增多。 二、Ang II對VEC內Ca2+濃度、MMP和培養(yǎng)上清液中ET含量的影響：生理情況下，低濃度的Ang II能維持血管的構造和張力；在病理情況下Ang II的濃度升高，可導致內皮細胞損傷。本研究觀察到Ang II可引起VEC內Ca2+濃度升高、MMP下降和培養(yǎng)上清液中ET含量升高，造成了VEC的損傷。其機制可能為Ang II作用于VEC的血管緊張素II1型受體(AT1)，使4，5-

12、二磷酸磷脂酰肌醇生成三磷酸肌醇(IP3)增多，IP3可以誘導內質網(wǎng)Ca2+的釋放；Ang II能夠抑制VEC鈣激活鉀通道的作用，使VEC膜上的Na+-K+ATP酶活性降低，Na+- K+泵功能障礙，導致細胞膜去極化而引起電壓依賴型Ca2+通道開放，Ca2+內流；Ang II導致的VEC內鈣超載以及氧化應激，均可造成MMP的下降；Ang II刺激VEC內皮素前體的轉錄進而促進ET的分泌。 三、缺氧聯(lián)合Ang II對VEC內Ca2+

13、濃度、MMP和培養(yǎng)上清液中ET含量的影響：既往的研究大都是將缺氧與Ang II分別單獨作用于血管內皮細胞后，觀察血管內皮細胞內Ca2+濃度、MMP及培養(yǎng)上清中ET含量的變化，以評價血管內皮細胞的功能，本研究將缺氧與Ang II聯(lián)合作用于VEC，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合作用與單純缺氧或Ang II作用比較，VEC內Ca2+濃度升高、MMP下降和培養(yǎng)上清液中ET含量增加均更加顯著，提示缺氧與Ang II對VEC的損傷有協(xié)同作用。其原因可能為缺氧比Ang

14、 II導致的VEC氧化應激損傷更強烈，而Ang II除具有導致氧化應激損傷外，還能作用于AT1受體，進一步通過IP3途徑造成VEC的損傷。可以說Ang II加強了缺氧對VEC的損傷作用，從而使VEC的損傷較單純缺氧作用及單純Ang II作用加重。 四、銀杏葉提取物對VEC內Ca2+濃度、MMP和培養(yǎng)上清液中ET含量的影響：細胞內Ca2+集聚是細胞不可逆性損傷過程中的重要環(huán)節(jié)，而VEC損傷后發(fā)生的功能改變則是導致相關疾病發(fā)生發(fā)展的

15、重要因素，因此，避免或減輕VEC氧化應激損傷以及防止和減輕細胞內Ca2+集聚是防治細胞不可逆損傷的重要環(huán)節(jié)。GBE既能清除自由基、提高抗氧化酶活性，保證線粒體膜的穩(wěn)定性，又能對抗Ang II抑制VEC的鈣激活鉀通道作用，最終可能激活VEC膜上的Na+-K+酶的活性，降低Ca2+通道的活性，阻止Ca2+內流及肌漿網(wǎng)Ca2+的釋放，從而顯示出鈣通道阻滯劑的作用而有效抑制細胞內鈣離子超載，避免MPT的開放，穩(wěn)定MMP，也最終阻斷ET mRNA

16、的過多表達，達到降低ET水平的結果，表現(xiàn)出細胞保護作用。本研究結果表明GBE確實能減輕損傷所致的細胞內Ca2+濃度升高、MMP下降及ET分泌量增加的程度，提示其對缺氧和Ang II引起VEC損傷具有保護作用。但這種保護作用是不完全的，原因可能為GBE發(fā)揮的生物活性作用主要是抗氧化作用，不是完全的Ca2+通道阻滯劑，僅能部分阻滯胞外Ca2+內流；對激活Ca2+泵的作用有限；不能完全抑制內儲鈣的釋放；其藥理作用的發(fā)揮可能存在時-效和量-效關

17、系，因此，GBE對VEC的保護作用是有限的。提示聯(lián)合應用VEC保護藥物及選擇合適的藥物濃度是今后研究的重點。 結論： 1.缺氧及Ang II可損傷VEC，導致Ca2+濃度升高、MMP下降和ET分泌量增加。 2.缺氧與Ang II聯(lián)合作用可使VEC內Ca2+濃度升高、MMP下降和ET分泌量增加均更加顯著，表明二者對VEC的損傷具有協(xié)同作用，提示在機體缺氧損傷過程中產生的Angll可加強缺氧對VEC的損害。