1、目的:以弓形蟲(chóng)PRU-T2株感染巨噬細(xì)胞建立體外感染模型,免疫熒光技術(shù)檢測(cè)含蟲(chóng)空泡膜上介導(dǎo)其與溶酶體融合的三種蛋白(Rab5、Rab7、EEA-1)的動(dòng)態(tài)變化。研究弓形蟲(chóng)抑制含蟲(chóng)空泡與溶酶體融合的機(jī)制,為闡明弓形蟲(chóng)免疫逃逸的機(jī)制及合理設(shè)計(jì)其疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、建立體外弓形蟲(chóng)感染細(xì)胞模型分別培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠脾臟巨噬細(xì)胞、小鼠肺泡巨噬細(xì)胞、RAW264.7鼠傳代巨噬細(xì)胞,用PRU-T2弓形蟲(chóng)感染細(xì)胞

2、(以滅活的PRU-T2弓形蟲(chóng)為陰性對(duì)照),分別于30 min、60 min、90 min及120 min取出蓋玻片,固定,瑞氏染色。比較弓形蟲(chóng)入侵以上4種細(xì)胞形成含蟲(chóng)空泡的時(shí)間與數(shù)量。選擇合適的細(xì)胞用于下一步研究。
　　2、間接免疫熒光技術(shù)分別檢測(cè)Rab5、Rab7、EEA-1在含蟲(chóng)空泡膜上的動(dòng)態(tài)分布取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化吹散;將細(xì)胞鋪于預(yù)置有蓋玻片的24孔板中,待細(xì)胞爬片后將弓形蟲(chóng)加入到孔中感染巨噬細(xì)胞;取出蓋玻片,用4％多聚甲醛

3、固定10-30min;用0.5%Triton-100處理10-20min;加入2%胎牛白蛋白,37℃溫箱中孵育1h封閉;加入適當(dāng)稀釋比的一抗工作液,4℃過(guò)夜;洗滌,加二抗,37℃溫箱中孵育1h;洗滌,晾干,攝像。
　　結(jié)果:
　　1、比較了PRU-T2弓形蟲(chóng)感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠脾臟巨噬細(xì)胞、小鼠肺泡腔巨噬細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響及含蟲(chóng)空泡形成的時(shí)間與數(shù)量。從接種鼠腹腔取出4℃放置1-2天的蟲(chóng)體,分別

4、感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠脾臟巨噬細(xì)胞、小鼠肺泡腔巨噬細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞,于30min計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞中含蟲(chóng)泡的數(shù)量分別是50、10-50、50-80、50-100。
　　2、Rab5在含蟲(chóng)空泡膜上持續(xù)存在,在熱滅活弓形蟲(chóng)吞噬體上隨著時(shí)間的推移,含量下降直至消失;在含蟲(chóng)空泡膜上檢測(cè)不到Rab7,在熱滅活弓形蟲(chóng)吞噬體膜上Rab7含量升高; EEA1(早內(nèi)體自身抗原1)在含蟲(chóng)空泡膜上無(wú),在熱滅活弓形蟲(chóng)吞噬體膜上存在。