1、背景：軟組織在維持面部和軀體輪廓中起著重要作用，軟組織缺損的修復(fù)重建目前仍然是整形外科面臨的挑戰(zhàn)之一，嚴(yán)重的深度燒傷，腫瘤切除術(shù)后，半側(cè)顏面萎縮等先天性缺損疾病等都存在軟組織缺損的問題。其中脂肪組織缺損是其主要表現(xiàn)之一。自Neuber在1893年完成了第1例用多個自體游離的小脂肪塊填充軟組織缺損的脂肪移植手術(shù)取得滿意的療效后，到20世紀(jì)初脂肪移植手術(shù)甚為流行。因此項技術(shù)操作簡單，不需附加切口，不留瘢痕，組織相容性好，所以在整形及美容外科

2、的許多方面得到廣泛的應(yīng)用.但是因為存在著脂肪細(xì)胞成活率低，較高的吸收率和纖維化問題，臨床效果并不理想.另外脂肪移植后的吸收率的檢查缺乏一個客觀的標(biāo)準(zhǔn)。 對前脂肪細(xì)胞性質(zhì)的認(rèn)識為將脂肪視為可移植的組織材料奠定了堅實的基礎(chǔ)。前脂肪細(xì)胞不含脂滴，體積小，有促血管生成特性，在細(xì)胞的收集與移植過程中比成熟的脂肪細(xì)胞更能耐受缺血與創(chuàng)傷，在脂肪移植后的缺血期，使單個細(xì)胞比塊狀脂肪更易通過細(xì)胞融合而成活.如果我們利用現(xiàn)有的理論，首先得到患者的前

3、體脂肪細(xì)胞，然后在體外促進(jìn)其增殖分化成成熟的脂肪細(xì)胞，就可以隨時用它來填充自身的軟組織缺損。這就等于建立了一個無限量的脂肪組織庫，我們可以根據(jù)需要隨時取貨。目前對人前脂肪細(xì)胞的生物學(xué)特性還處于研究階段。 目的： 1、通過臨床研究建立一個客觀脂肪移植成活率的影象學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)，并借此觀察臨床bFGF對注射脂肪成活率的作用； 2、觀察bFGF對體外培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響。 3、觀察bFGF對移植于裸鼠體

4、內(nèi)前脂肪細(xì)胞成脂的影響。為脂肪細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用開辟一條新的思路。 方法： (一)1、無菌條件下抽吸的脂肪組織消化、用酶消化法，體外分離培養(yǎng)Pra，并進(jìn)行傳代擴(kuò)增；觀察細(xì)胞形態(tài)。 2、將第二代細(xì)胞按104個/孔(含100μ1培養(yǎng)液)接種于96孔板(每板分2組，每組3x8孔，其中1組為對照)，實驗組加入生長因子(bFGF10ng/ml)，每天以MTT法觀測細(xì)胞增殖情況，繪制生長曲線。 3、將第二代細(xì)胞按10

5、4個/孔(含100μl培養(yǎng)液)接種于96孔板(每板分2組，每組3×8孔，其中1組為對照)。培養(yǎng)2天待細(xì)胞融合后后加入分化培養(yǎng)基，實驗組加入生長因子(bFGF10ng/ml)，對照組為僅含10％小牛血清的人前脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)液。測定脂肪細(xì)胞甘油三酯的合成量。 4、統(tǒng)計學(xué)方法處理。 (二)1、制備前脂肪細(xì)胞懸液：第二代前脂肪細(xì)胞以3×104/ml密度接種培養(yǎng)瓶中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)，第2天，換分化培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后，胰酶

6、消化，以普通培養(yǎng)液制成3x104/ml細(xì)胞懸液，分成兩組，A組內(nèi)含10ng/ml重組人bFGF；B組不含重組人bFGF。 2、ADM用15％胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡24h待用。 3、細(xì)胞生物支架復(fù)合體的制備：將經(jīng)15％胎牛血清：DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡過的片狀生物支架置于培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1片，共12孔。實驗分為三組，每組4孔，a組加入A組細(xì)胞懸液100μl；b組加入B組細(xì)胞懸液100μl；c組加入不含細(xì)胞的普通

7、培養(yǎng)液100μ1.各組液體由移液槍均勻滴在ADM表面，靜置10分鐘。 4、細(xì)胞支架復(fù)合體植入裸鼠皮下，8周后取材。 5、組織學(xué)檢查：將上述標(biāo)本材料經(jīng)10％中性甲醛固定后，石蠟包埋并切片，HE染色，觀察其組織學(xué)變化。 6、在200倍光鏡下，每張切片選5個視野，記數(shù)生成脂肪細(xì)胞數(shù)目，取平均植(x±s表示)代表脂肪密度，比較三組間差異。 7、免疫組織化學(xué)檢查鑒定脂肪組織來源。 (三)1、2006年1月-

8、2007年1月，選取女性雙側(cè)顳部凹陷要求手術(shù)者20例行顆粒脂肪注射填充術(shù)。 2、自體脂肪顆粒的制備：采用注射器針式吸脂法(16號針頭)，于皮下脂肪層放射狀吸取足量脂肪混懸液，過濾、沖洗，每20ml脂肪顆粒中注入堿性成纖維細(xì)胞生長因子2000U及慶大霉素8000U，混勻備用。 3、脂肪顆粒的注射：注射總量約為預(yù)測脂肪量×150％+局部浸潤麻藥量。 4、注射手術(shù)結(jié)束后第二天、三月分別照相，CT成像。 5、3月

9、后技算脂肪吸收率，判斷療效。 結(jié)果： (一)1、重組人bFGF對前脂肪細(xì)胞有明顯的促增殖作用，與對照組比較第1，2天差異不明顯，隨時間的推移，第6-7天到達(dá)高峰，與對照組比較差異顯著；bFGF刺激前脂肪細(xì)胞倍增時間提前12小時。 2、加入bFGF(10ng/ml)的前脂肪細(xì)胞分化提前，細(xì)胞內(nèi)合成的脂肪小滴更多；誘導(dǎo)分化第3天時，前脂肪細(xì)胞中甘油三酯總量輕度升高，到分化6天和9天時，甘油三酯總量明顯升高，與對照組相

10、比差異均有顯著性。 (二)1、8周后取材的細(xì)胞支架復(fù)合體HE染色顯示 (1)c組，在裸鼠皮下，脫細(xì)胞異體真皮支架表面和真皮內(nèi)都沒有觀察到脂肪細(xì)胞； (2)b組，在裸鼠皮下，脫細(xì)胞異體真皮支架表面和真皮內(nèi)有脂肪細(xì)胞存活，但脂肪細(xì)胞散在，密度較a組低； (3)a組，成活的脂肪細(xì)胞較多，在真皮表面有成團(tuán)的脂肪細(xì)胞，脂肪細(xì)胞可深入真皮內(nèi)。在放大200倍鏡下a組脂肪細(xì)胞的數(shù)目(77±56/視野)較b組(66±44/

11、視野)增加明顯。支架內(nèi)有新生血管形成。 2、免疫組化顯示a、b組組都有陽性細(xì)胞染色，證明存活的脂肪細(xì)胞是人源性的。A組陽性細(xì)胞較b組陽性細(xì)胞多，c組無陽性細(xì)胞染色。 (三)1、本組20例40個凹陷部位，每部位每次脂肪顆粒注射量10ml～16ml，平均11ml術(shù)，后無感染、血腫、脂肪液化、脂肪栓塞發(fā)生，1-3月內(nèi)均可見移植物部分吸收體積變小，3個月后外形基本穩(wěn)定。一次注射后優(yōu)16個部位(40％)，良20個部位(50％)，差

12、4個部位(10％)。 2、CT檢測3月后注射脂肪吸收率27％±5.6％ 結(jié)論： 1、bFGF對體外培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞的有明顯的促增殖分化作用。 2、bFGF對移植于裸鼠體內(nèi)的人前脂肪細(xì)胞有明顯的促成脂作用。其可能原因為bFGF促進(jìn)了脂肪細(xì)胞的在體內(nèi)的增殖和分化；bFGF縮短了移植組織內(nèi)形成血管的時間，使移植的脂肪細(xì)胞縮短了體內(nèi)缺血缺氧的時間，有更多的脂肪細(xì)胞存活。 3、脫細(xì)胞異體真皮是一種良好的脂肪