1、1．背景與目的： 隨著人們生活水平的提高，冠心病的發(fā)病逐年增多，已成為威脅人類健康的主要疾病。藥物治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)治療和外科冠脈旁路移植手術(shù)即冠狀動(dòng)脈“搭橋”(CABG)是治療冠心病的三種手段和方法，但臨床上尚有很大一部分病例療效尚不理想。血管再生治療是目前研究的一大熱點(diǎn)，為缺血性心臟病尤其是那些不適合于PCI、CABG及內(nèi)科藥物治療或效果極差的病人開(kāi)辟了新的治療途徑。 組織損傷后傷口及其附近上皮存在的損

2、傷電流場(chǎng)源是一種穩(wěn)恒直流電場(chǎng)，具有促使損傷愈合等生物學(xué)效應(yīng)。內(nèi)源性電場(chǎng)不僅可使組織細(xì)胞分裂、增殖、向傷口定向遷移、重塑，而且可刺激血管細(xì)胞向傷口趨電遷移，損傷組織出現(xiàn)血管“發(fā)芽”再生。而血管新生、組織得以血液灌注是損傷愈合的關(guān)鍵。組織缺血性損傷后往往血管再生不足，能使血管“發(fā)芽”再生有明顯效果的電場(chǎng)強(qiáng)度為150-400 mV/mm，而缺血心肌細(xì)胞自發(fā)損傷電場(chǎng)為5.8mV/mm，如此弱的電場(chǎng)是不可能對(duì)血管生成有影響的。 因而通過(guò)電

3、刺激來(lái)促進(jìn)血管新生及側(cè)支循環(huán)的形成可能翻開(kāi)治療缺血性損傷的新篇章。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，于大鼠缺血肢體的缺血和非缺血位置施加低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng)，能使肌肉和內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)產(chǎn)量明顯增加，進(jìn)而大量新生血管形成，肢體缺血得以明顯改善。 此外，外加穩(wěn)恒直流電場(chǎng)已廣泛地成功治療各種皮膚及非皮膚損傷。研究表明，機(jī)體自身產(chǎn)生的生物電場(chǎng)不足以促進(jìn)損傷愈合的進(jìn)程時(shí)(如患有糖尿病，缺血性疾病)，在損傷區(qū)和未損傷區(qū)之間施加外加電場(chǎng)能明顯增強(qiáng)損傷愈合速率。

4、 然而，外加穩(wěn)恒直流電場(chǎng)也是否如同作用于皮膚和肢體等組織損傷一樣，于缺血(梗死)心肌的缺血和非缺血區(qū)域施加適宜的穩(wěn)恒直流電場(chǎng)是否也促進(jìn)大量血管新生及側(cè)支循環(huán)形成?也可促進(jìn)缺血(梗死)損傷心肌的修復(fù)和再生?缺血心肌血供、心室重塑及心功能是否得以改善? 電流通過(guò)組織時(shí)會(huì)產(chǎn)生電熱、電化學(xué)及電生理等也可能對(duì)組織有害的反應(yīng)，對(duì)上述150-400mV/mm穩(wěn)恒直流電場(chǎng)直接作用于心臟的安全性評(píng)估，目前研究尚少。 本課題以家兔心臟

5、為研究基本模型，旨在將穩(wěn)恒直流電場(chǎng)用于心肌缺血(梗死)治療，對(duì)其安全性和有效性進(jìn)行初步探索。 2．方法 第一部分初步探索外加穩(wěn)恒直流電場(chǎng)直接作用于心臟的安全范圍。 (1)將WYJ系列高精度直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電源等制作成穩(wěn)恒直流電場(chǎng)發(fā)生裝置，將含景99％鉑(Pt)條制成1對(duì)極身1.0cm長(zhǎng)Pt電極。 (2)探討低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng)對(duì)組織間液的電化學(xué)作用。中國(guó)家兔10只，經(jīng)心臟直接采取已肝素化動(dòng)脈血代管組織間液加入希托

6、夫管中施以4.5V或6.0V穩(wěn)恒直流電電解1h。留取正常血液及電解完畢后陰極管、陽(yáng)極管和中間管血液，分別測(cè)定其pH值及HCO<,3><'->、K<'+>、Na<'+>、Cl<'->、Ca<'2+>等離子濃度。 (3)探討正常家兔心臟受低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng)直接作用對(duì)心電活動(dòng)及血流動(dòng)力學(xué)的影響。家兔開(kāi)胸后直接在心外膜上，以冠狀動(dòng)脈左室支的主支下段為中線平行安放一對(duì)Pt電極，施與0～6V/cm穩(wěn)恒直流電場(chǎng)，監(jiān)測(cè)體表肢導(dǎo)聯(lián)ECG、有創(chuàng)監(jiān)測(cè)股

7、動(dòng)脈血壓和左心室內(nèi)壓，測(cè)量、分析ECG和血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 (4)探討低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng)直接作用于正常家兔心臟對(duì)心臟的電損傷。上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)監(jiān)測(cè)正電極處心外膜表面溫度，光鏡和電鏡觀察心肌組織學(xué)變化。 第二部分在家兔模型梗死心肌局部施加平面和透壁兩種作用方式、2.0V和3.0V兩種強(qiáng)度的穩(wěn)恒直流電場(chǎng)，探索其促進(jìn)缺血(梗死)心肌修復(fù)的有效性。 (1)在非人工通氣的情況下建立心肌缺血(梗死)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。10只開(kāi)胸行心

8、臟冠狀動(dòng)脈左室支結(jié)扎作為冠脈結(jié)扎組，5只開(kāi)胸后不結(jié)扎冠脈作為假手術(shù)組。4周后處死，觀測(cè)其心電圖、血流動(dòng)力學(xué)等參數(shù)和心臟組織學(xué)特征。 (2)外加低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng)促進(jìn)兔梗死心肌修復(fù)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究。健康中國(guó)家兔40只均予冠脈結(jié)扎。隨機(jī)分配為以下5組，①心肌梗死(MI)組；②平面電場(chǎng)2v(PEF2V)組；③平面電場(chǎng)3V(PEF3V)組；④透壁電場(chǎng)2V(TEF2V)組；⑤透壁電場(chǎng)3V(TEF3V)組。分別給與相應(yīng)類型和劑量的直流電場(chǎng)干預(yù)。

9、4周后去甲腎上腺素激發(fā)實(shí)驗(yàn)分析心功能；處死動(dòng)物后，測(cè)量心系數(shù)，肺系數(shù)，肝系數(shù)，肺臟濕重與干重比率，肝臟濕重與干重比率；對(duì)梗死部位心肌組織進(jìn)行Masson染色，評(píng)估心肌梗死面積；評(píng)估心肌纖維化程度；免疫組織化學(xué)染色和Western Blot測(cè)定Ⅰ型膠原纖維/Ⅲ型膠原纖維的蛋白表達(dá)；CD31免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)毛細(xì)血管密度。 (3)外加低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng)在促進(jìn)兔心肌梗死模型損傷修復(fù)中的心肌細(xì)胞增殖和凋亡效應(yīng)。繼續(xù)觀察上述心肌組織，Ki

10、-67核抗原標(biāo)記檢測(cè)心肌細(xì)胞增殖；TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡；免疫組織化學(xué)染色和Western Blot測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡基因相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax的表達(dá)。 3．結(jié)果(1)改進(jìn)的WYJ直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電源其電壓在0～.5V均精細(xì)可調(diào)；自制的鉑電極在電場(chǎng)5V/cm時(shí)電極板處電流密度最高僅為0.089 mA/cm<'2>，且作用1 h后心肌組織均無(wú)肉眼可見(jiàn)的組織電灼傷。 (2)6.0V以下穩(wěn)恒直流電場(chǎng)對(duì)組織間液的電化學(xué)作用對(duì)

11、組織的損害可以忽略不計(jì)；場(chǎng)強(qiáng)≤3.0 V/cm對(duì)ECG參數(shù)和血流動(dòng)力學(xué)的影響均在安全范圍；場(chǎng)強(qiáng)≤3.5V/cm)不會(huì)出現(xiàn)電擊和組織學(xué)損傷。 (3)與冠脈假結(jié)扎組比較，冠脈結(jié)扎組其ECG和組織學(xué)特征均表現(xiàn)為心肌梗死；4周后去甲腎上腺素激發(fā)實(shí)驗(yàn)心功能分析，評(píng)定心臟收縮功能的指標(biāo)LVSP、+dp/dtmax和t-+dp/dtmax，冠脈結(jié)扎組降低和縮短，而冠脈結(jié)扎組評(píng)定心臟舒張功能的指標(biāo)LVEDP升高、而-dp/dtmax降低。

12、 (4)心肌梗死組與各電場(chǎng)干預(yù)組間心、肺、肝等有關(guān)參數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；去甲腎上腺素心功能激發(fā)實(shí)驗(yàn)表明，PEF2V、TEF2V和TEF3V治療可改善心肌梗死后的收縮及舒張功能；在梗死面積的縮小及梗死區(qū)邊緣帶纖維化程度降低方面，透壁電場(chǎng)優(yōu)于平面電場(chǎng)；兩透壁電場(chǎng)還有利于ECM中膠原的重塑；TEF3V不僅可明顯促進(jìn)非梗死區(qū)毛細(xì)血管的形成，而且也可促進(jìn)梗死區(qū)邊緣帶和梗死區(qū)毛細(xì)血管的形成，尤以非梗死區(qū)明顯。 (5)電場(chǎng)干預(yù)后在非梗死區(qū)，PE

13、F2V及TEF3V均能明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖；在梗死區(qū)邊緣帶，各電場(chǎng)干預(yù)組均表現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞增殖，兩透壁電場(chǎng)作用均優(yōu)越于兩平面電場(chǎng)；與心肌梗死組對(duì)照相比，僅在梗死區(qū)邊緣帶PEF2V及TEF3V對(duì)心肌細(xì)胞凋亡有明顯抑制；心肌細(xì)胞中凋亡基因相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax主要在非梗死區(qū)和梗死區(qū)邊緣帶表達(dá)，以邊緣帶區(qū)為主。且在非梗死區(qū)和梗死區(qū)邊緣帶，Bcl-2的表達(dá)在各組間表現(xiàn)為逐步增加的趨勢(shì)；透壁電場(chǎng)組作用均強(qiáng)于平面電場(chǎng)組。而B(niǎo)ax的表達(dá)正好與之

14、相反。 4．結(jié)論 (1)改進(jìn)的WYJ直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電源以及自制的鉑電極完全能滿足本課題研究的需要；場(chǎng)強(qiáng)≤3.0 V/cm的外加穩(wěn)恒直流電場(chǎng)對(duì)家兔心電活動(dòng)、血流動(dòng)力學(xué)、組織間液的電化學(xué)作用、組織學(xué)電損傷等無(wú)明顯影響，因而是安全的。 (2)根據(jù)兔心在胸腔的解剖學(xué)位置特征，在非人工通氣的情況下建立的心肌缺血(梗死)模型的制作方法，有效、簡(jiǎn)便和實(shí)用，為電場(chǎng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)平臺(tái)。 (3)在兔模型梗死心肌局部施加平面

15、和透壁兩種作用方式、2.0V和3.0V/cm兩種強(qiáng)度的穩(wěn)恒直流電場(chǎng)。結(jié)果顯示： ①適宜的低壓穩(wěn)恒直流電場(chǎng)促進(jìn)了血管新生和側(cè)支循環(huán)形成，縮小了梗死面積，降低了心肌纖維化程度，減輕了左心室病理的重塑，改善了左心室功能，對(duì)慢性缺血和心肌梗死模型的心肌起到了保護(hù)作用。 ②適宜的外加穩(wěn)恒直流電場(chǎng)可促進(jìn)心肌梗死后心肌細(xì)胞增殖，抑制心肌細(xì)胞的凋亡，這可能有利于梗死后心臟的再生與功能修復(fù)。 ③總體上，透壁電場(chǎng)作用方式，尤以透壁電