1、目的：復方斑蝥膠囊是根據(jù)衛(wèi)生部頒布的標準生產(chǎn)的純中藥膠囊制劑，臨床上以治療原發(fā)性肝癌為主，療效較好，但其作用機制卻不甚明了。本研究運用中藥血清藥理學結合蛋白質(zhì)組學相關方法，分析復方斑蝥膠囊血清誘導人肝癌SMMC-7721細胞蛋白質(zhì)組的差異表達，有助于從整體水平監(jiān)測藥物作用下蛋白質(zhì)分子的變化規(guī)律，尋找出可能介導復方斑蝥膠囊作用的生物分子、作用靶點，從分子細胞水平推測該藥的可能作用機制。 方法：1．制備復方斑蝥膠囊血清和對照血清并處

2、理肝癌SMMC-7721細胞72h后收集細胞裂解提取蛋白質(zhì)。 2．用雙向凝膠電泳(2-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)分別分離藥物處理細胞和對照細胞蛋白質(zhì)，采用寬范圍(pH3-10L)結合窄范圍(pH4-7L)的IPG膠條進行分離，經(jīng)考馬斯亮藍染色后用PDQuest軟件進行圖像分析。 3．對差異表達蛋白斑點用胰酶進行膠內(nèi)酶切，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS

3、)分析酶切片斷，得到肽質(zhì)量指紋圖(PMF)，使用國際互聯(lián)網(wǎng)上MatrixScience公司提供的PMF鑒定程序(Mascot：PeptideMassFingerprint)進行查詢鑒定。 結果：1．寬范圍的IPG膠條(pH3-10L)比較復方斑蝥膠囊血清處理細胞和對照細胞蛋白質(zhì)2-DE圖譜顯示，蛋白質(zhì)主要集中在相對分子質(zhì)量(Mr)范圍在14.4-75kDa內(nèi)，等電點(pI)主要分布在pH4.0-8.0之間。PDQuest軟件分析

4、圖像，檢測到pH3-10L膠條分離處理細胞和對照細胞的蛋白點約為450個，兩倍以上顯著性量變的點有47個，且差異蛋白點主要集中在pH4-7的范圍內(nèi)，對照蛋白和處理細胞蛋白圖譜之間的匹配率為72％。窄范圍的IPG膠條(pH4-7L)電泳圖譜顯示大約570個點，兩倍以上量變的蛋白點有53個。對照蛋白和處理細胞蛋白圖譜間的匹配率為79％。 2．對13個差異候選蛋白點進行MALDI-TOF-MS鑒定，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢，4個蛋白點獲得了有意義

5、的結果(p＜0.05)，分別為70kDa熱休克蛋白(Heatshock70kDaprotein8，)、膜聯(lián)蛋白A5(AnnexinA5，ANXA5)、真核翻譯起始因子5A(Eukaryotictranslationinitiationfactor5A，eIF-5A)和硫氧還蛋白過氧化酶2(Peroxiredoxin-2，PRDX2)。其中ANXA5和HSP70在藥物處理細胞中表達上調(diào)，另外兩種蛋白表達下調(diào)。 結論：1．中藥抗癌是

6、一個涉及多成分、多靶點、多因素參與的復雜過程，在復方斑蝥膠囊抵抗人肝細胞癌SMMC-7721細胞的過程中既有下調(diào)抗凋亡蛋白PRDX2的合成來抑制抗凋亡作用，也有下調(diào)eIF-5A導致細胞周期阻滯而促進凋亡，和上調(diào)annexinV以促進抗增殖作用及逆轉多藥耐藥及上調(diào)HSP70促進抗腫瘤免疫等多種機制的共同參與。 2．HSP70細胞外HSP70是一種強效的腫瘤免疫治療因子，它能對抗腫瘤抗原耐受性，導致細胞毒性T細胞的特異性腫瘤細胞殺傷

7、效應，高表達的HSP70能夠阻止促炎癥反應抗凋亡因子——NF-kappa-B的活化和核轉運而促進癌細胞凋亡，HSP70表達上調(diào)有可能促進其它聯(lián)用藥物的抗腫瘤免疫反應。 3．活性eIF-5A是維持哺乳動物細胞、酵母和古細菌生長的必要因子，活性eIF-5A參與調(diào)控細胞G(1)-S轉化的蛋白表達過程。它的下調(diào)可導致極強的抗增殖效應，使哺乳動物細胞包括多種癌細胞系在內(nèi)出現(xiàn)細胞周期阻滯。 4．ANXA5是蛋白激酶C和磷脂酶A2的內(nèi)