1、背景與目的:
　　惡性腫瘤是一類全身性、致命性疾病,早期確診和治療非常重要。雖然目前常用的醫(yī)學(xué)影像設(shè)備(如CT、MRI、PET/CT、B超)為腫瘤的診斷提供了可靠、無創(chuàng)的手段,應(yīng)用增強(qiáng)掃描對鑒別腫瘤的良惡性提供了較大價(jià)值。但這些診斷技術(shù)對早期或者較小病變(如肺部小結(jié)節(jié))的良惡性判斷仍然存在一定難度,有些病變(如軟組織腫瘤)即使已較大,其良惡性判斷也很難,此外,有些良性病變的血供也很豐富,依靠增強(qiáng)掃描也難與惡性腫瘤鑒別。目前,惡性腫

2、瘤的確診主要依靠病理學(xué)檢測,它主要從細(xì)胞、分子及基因等水平對疾病進(jìn)行診斷,比依靠病變解剖形態(tài)、血供、代謝的異常改變進(jìn)行診斷更為確切,是診斷惡性腫瘤的“金標(biāo)準(zhǔn)”;其中,腫瘤標(biāo)記物的檢測已被廣泛用于惡性腫瘤的診斷、指導(dǎo)治療方法的選擇以及預(yù)后的判斷中。
　　研究表明,在>85％的惡性腫瘤內(nèi)可檢測到端粒酶活性,而在正常(除少數(shù)正常需要更新)的組織和良性病變中端粒酶為失活狀態(tài),這表明端粒酶可作為惡性腫瘤的特異性標(biāo)記物。由于端粒酶的活性表達(dá)是

3、腫瘤細(xì)胞獲得無限增殖能力的基礎(chǔ),與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后均有密切聯(lián)系。更為重要的是,與其他腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、前列腺癌特異性抗原(PSA)等只針對某特定來源腫瘤的標(biāo)志物相比,端粒酶活性與腫瘤的組織來源無關(guān),可用于廣譜惡性腫瘤的診斷。但目前端粒酶活性的檢測主要依靠病理學(xué)方法,這需要先獲取病灶標(biāo)本,而有些病變位置較深或鄰近心臟大血管等特殊部位,不易進(jìn)行取材。因此有必要建立一種無創(chuàng)性檢測組織細(xì)胞端粒酶活性的

4、方法,從而達(dá)到活體特異性診斷惡性腫瘤的目的。
　　國內(nèi)外許多研究充分證實(shí):細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白濃度增加,可使細(xì)胞攝取更多的鐵離子,導(dǎo)致周圍質(zhì)子的橫向弛豫率顯著升高,其MR信號發(fā)生變化,表明鐵蛋白可作為報(bào)告基因用于MR成像。如果能使鐵蛋白基因靶向性高表達(dá)于端粒酶陽性細(xì)胞內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)應(yīng)用MR成像無創(chuàng)性檢測端粒酶活性的目的。大量研究表明人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的啟動(dòng)子可調(diào)控基因靶向性表達(dá)于端粒酶陽性細(xì)胞內(nèi),是目前已知最廣譜的惡性腫瘤特異性啟

5、動(dòng)子。因此,我們設(shè)想將鐵蛋白置于 hTERT啟動(dòng)子的調(diào)控之下,則該報(bào)告基因可靶向性高表達(dá)于惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致此類細(xì)胞的MR信號發(fā)生改變。通過此方法有望實(shí)現(xiàn)應(yīng)用MR成像技術(shù)無創(chuàng)性檢測腫瘤端粒酶活性,從而可實(shí)現(xiàn)活體早期特異性診斷惡性腫瘤的目的。
　　綜上分析,本研究通過構(gòu)建由hTERT啟動(dòng)子調(diào)控MR鐵蛋白重鏈(Fth)報(bào)告基因表達(dá)的慢病毒載體,將其感染體外細(xì)胞。探索hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的MR報(bào)告基因成像技術(shù)檢測體外腫瘤細(xì)胞端粒酶活性

6、的可行性,為進(jìn)一步應(yīng)用該成像技術(shù)活體診斷惡性腫瘤提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。
　　方法:
　　1)制備慢病毒載體Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro和Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro
　　人工合成鐵蛋白重鏈( Fth1)基因并連接上3flag序列,然后克隆入pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體的多克隆位點(diǎn)內(nèi),獲得pCDH-CMV-Fth1-3flag-Puro對照載體;應(yīng)用 P

7、CR法擴(kuò)增得到 hTERT啟動(dòng)子基因片段,然后替換 CMV啟動(dòng)子獲得pCDH-hTERT-Fth1-3flag-Puro目的載體。將上述2種表達(dá)載體分別同pCD/NL-BH*DDD包裝質(zhì)粒、pLTR-G膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒共感染293T包裝細(xì)胞,收集慢病毒上清,采用定量PCR法測定病毒滴度。將所得慢病毒載體分別命名為 Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro和Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro。
　　2)M

8、R成像檢測腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的體外研究
　　分別應(yīng)用慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro和Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro載體感染端粒酶陽性細(xì)胞(A549、SKOV3和293T)以及端粒酶陰性細(xì)胞(U2OS和HPDLF)。其中,感染慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro載體的3株端粒酶陽性細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,感染慢病毒 Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro載體

9、的5株細(xì)胞為陽性對照組,感染慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro載體的2株端粒酶陰性細(xì)胞和未感染慢病毒載體的5株細(xì)胞為陰性對照組。采用免疫熒光染色檢測各細(xì)胞內(nèi) flag表達(dá)情況,采用 EILSA檢測各細(xì)胞Fth表達(dá)水平。應(yīng)用CCK-8試劑檢測感染慢病毒載體以及添加FAC培養(yǎng)細(xì)胞對細(xì)胞增殖活性的影響,應(yīng)用普魯士藍(lán)鐵染色和總鐵檢測試劑盒檢測細(xì)胞聚鐵效能,采用MR掃描檢測細(xì)胞T2*WI信號變化。
　　結(jié)果:

10、>　　1)經(jīng)酶切及測序證實(shí)鐵蛋白重鏈(Fth1)報(bào)告基因合成成功并準(zhǔn)確插入載體內(nèi), hTERT啟動(dòng)子基因擴(kuò)增成功并正確重組入表達(dá)載體內(nèi),成功構(gòu)建目的載體和對照載體;將所得表達(dá)載體進(jìn)行慢病毒包裝,所得兩種病毒滴度約為5 x108TU/ml,可滿足實(shí)驗(yàn)所需。
　　2)細(xì)胞感染慢病毒載體后,應(yīng)用免疫熒光染色檢測各細(xì)胞(包括感染和未感染者)內(nèi)flag蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示:感染慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro載

11、體后,只有端粒酶陽性(A549、SKOV3和293T)細(xì)胞內(nèi)檢測到有flag蛋白的表達(dá),端粒酶陰性( U2OS和 HPDLF)細(xì)胞內(nèi)未能檢測到有 flag蛋白的表達(dá);而感染對照慢病毒Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro載體的5種細(xì)胞均檢測到有flag蛋白的表達(dá),未感染細(xì)胞內(nèi)均未檢測到flag蛋白的表達(dá)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各細(xì)胞內(nèi)Fth蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示:感染慢病毒載體 Lenti-hTERT-Fth1

12、-3flag-Puro的3株端粒酶陽性細(xì)胞(A549、SKOV3和293T)和感染慢病毒載體Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro的5株細(xì)胞Fth蛋白水平均較相應(yīng)未感染細(xì)胞顯著升高( p<0.05),而感染慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro載體的2株端粒酶陰性細(xì)胞(U2OS和HPDLF)的Fth蛋白水平較相應(yīng)未感染細(xì)胞無顯著變化(p>0.05)。
　　3)用CCK-8試劑檢測細(xì)胞增殖活性,結(jié)果

13、示:同種細(xì)胞感染或未感染慢病毒載體組(WT組、CMV組和hTERT組)細(xì)胞之間增殖活性無顯著差異(p>0.05),說明鐵蛋白的高表達(dá)不影響細(xì)胞增殖活性;同種細(xì)胞用補(bǔ)充或不補(bǔ)充FAC(1 mM)培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后,兩組(+FAC組和-FAC組)細(xì)胞之間增殖活性亦無明顯差異(p>0.05),說明補(bǔ)充FAC培養(yǎng)細(xì)胞亦不會影響細(xì)胞的增殖活性。細(xì)胞用添加FAC(終濃度1 mM)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行普魯士藍(lán)鐵染色,結(jié)果示:感染慢病毒載體Le

14、nti-hTERT-Fth1-3flag-Puro的3株端粒酶陽性細(xì)胞和感染對照慢病毒載體Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro的5株細(xì)胞內(nèi)均可見大量明顯藍(lán)染顆粒,而感染慢病毒載體Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro的2株端粒酶陰性細(xì)胞和未感染慢病毒載體的5株細(xì)胞內(nèi)僅見極少量淺淡的藍(lán)染顆粒。用同樣方法培養(yǎng)細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞總鐵含量檢測,結(jié)果示:感染慢病毒載體 Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Pur

15、o的端粒酶陽性細(xì)胞和感染對照慢病毒載體Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro的5株細(xì)胞鐵含量均較相應(yīng)未感染細(xì)胞顯著增加(p<0.05),而感染慢病毒載體 Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro的端粒酶陰性細(xì)胞鐵含量較未感染細(xì)胞無顯著變化(p>0.05),細(xì)胞含鐵量檢測結(jié)果與普魯士藍(lán)鐵染色一致,說明高表達(dá)鐵蛋白重鏈的細(xì)胞攝鐵能力明顯增強(qiáng)。
　　4)將細(xì)胞用補(bǔ)充有FAC(終濃度1 mM)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)

16、后進(jìn)行MR掃描,結(jié)果顯示:當(dāng)感染慢病毒載體 Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro后,3株端粒酶陽性細(xì)胞的T2*WI信號顯著下降,R2*值較相應(yīng)未感染細(xì)胞明顯升高(p<0.05),而2株陰性細(xì)胞的T2*WI信號無明顯降低,R2*值較未感染細(xì)胞無顯著變化(p>0.05);而感染對照慢病毒Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro載體后,5株細(xì)胞T2*WI信號均有明顯降低,R2*值均較未感染細(xì)胞明顯升高(p<0.05

17、)。說明感染慢病毒載體Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro后,只有端粒酶陽性細(xì)胞的MR信號發(fā)生改變。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建的慢病毒 Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro載體具有嚴(yán)格的端粒酶靶向特性。當(dāng)細(xì)胞該慢病毒載體感染后,只有端粒酶陽性的細(xì)胞會高表達(dá)鐵蛋白重鏈,導(dǎo)致細(xì)胞攝鐵量顯著增加,增加的鐵能顯著降低細(xì)胞的T2*WI信號,即只有端粒酶陽性細(xì)胞的MR信號會發(fā)生改變。說明應(yīng)用hT