1、帕金森病(Parkinson's Disease，PD)的主要病理改變是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性減少，引起黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺水平降低。服用左旋多巴制劑的多巴胺替代治療至今仍是最為有效的治療方法，但其遠(yuǎn)期療效欠佳，癥狀波動(dòng)，異動(dòng)癥以及精神癥狀長(zhǎng)期困擾著患者和醫(yī)療人員。細(xì)胞移植是目前帕金森病治療的新方法之一，如何在體外獲得足量的多巴胺能神經(jīng)元一直是神經(jīng)科學(xué)界面臨的一個(gè)難題。胎腦移植有比較好的效果，但是由于倫理束縛和來(lái)源限制，不能

2、夠得到廣泛應(yīng)用。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs)是骨髓內(nèi)的一種多潛能干細(xì)胞，在一定條件下，可分化為神經(jīng)細(xì)胞。它可以直接從個(gè)體骨髓中獲得，來(lái)源充足，取材方便，創(chuàng)傷小，且避免了移植技術(shù)難以逾越的移植排斥問(wèn)題和倫理學(xué)的束縛，因此BMSCs定向誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)元甚至是多巴胺能神經(jīng)元成為帕金森病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的機(jī)制還不確定。研究者認(rèn)為內(nèi)在基因機(jī)制和種系限制以及細(xì)

3、胞的命運(yùn)是可塑的，環(huán)境可以引起細(xì)胞多潛能作用的發(fā)揮。神經(jīng)組織或細(xì)胞微環(huán)境可以增強(qiáng)：BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化的能力。紋狀體是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元主要投射部位，是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)揮生理作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)將BMSCs移植到紋狀體，能夠改善帕金森病大鼠或小鼠的行為。其可能作用機(jī)制是：BMSCs具有分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的功能；BMSCs注入紋狀體后，在局部微環(huán)境的作用下分化為神經(jīng)細(xì)胞，如膠質(zhì)細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元等。又有體外實(shí)驗(yàn)表明紋

4、狀體提取液對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有促進(jìn)存活的作用，對(duì)細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用，還可以促進(jìn)細(xì)胞突觸生成。在進(jìn)化的過(guò)程中，哺乳動(dòng)物繼承了多方面的機(jī)制以保護(hù)自己應(yīng)對(duì)外來(lái)侵犯。帕金森病患者腦內(nèi)DA能神經(jīng)元70-80％丟失仍能保持正常運(yùn)動(dòng)，提示著一種自我保護(hù)機(jī)制。我們?cè)O(shè)想，帕金森大鼠紋狀體提取液可以促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，甚至分化為多巴胺能神經(jīng)元。我們進(jìn)一步設(shè)想正常紋狀體(正常側(cè))提取液和：PD紋狀體(損傷側(cè))提取液兩者問(wèn)具有誘導(dǎo)作用上的差異。因

5、此，我們進(jìn)行了帕金森大鼠紋狀體提取液誘導(dǎo)BMSCs的嘗試，以期利用紋狀體的生理作用以及紋狀體提取液對(duì)細(xì)胞的促分化作用和對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用，誘導(dǎo)BMSCs分化成為神經(jīng)細(xì)胞甚至是多巴胺能神經(jīng)元。同時(shí)比較正常紋狀體提取液與PD紋狀體提取液作用上的可能差異性。 本實(shí)驗(yàn)研究的目的：利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，為BMSCs紋狀體移植治療帕金森病的機(jī)制提供直接依據(jù)。具體實(shí)驗(yàn)步驟：1，幼年大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增與生物性狀觀察；2，帕金森大鼠

6、紋狀體提取液對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。 第一部分幼年大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)與觀察 目的：體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)超微結(jié)構(gòu)觀察和免疫組織化學(xué)檢測(cè)探討細(xì)胞生物學(xué)特性。 方法：收集幼年大鼠骨髓細(xì)胞，利用貼壁培養(yǎng)法純化擴(kuò)增。培養(yǎng)細(xì)胞至第三代，相差顯微鏡及HE染色，掃描電鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞形態(tài)；免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞表面神經(jīng)標(biāo)記物巢蛋白(Nestin)，神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron spe

7、cial enolase，NSE)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。 結(jié)果：電鏡下細(xì)胞表面見(jiàn)大量微絨毛結(jié)構(gòu)，一些細(xì)胞有單個(gè)或多個(gè)突起樣結(jié)構(gòu)。多數(shù)細(xì)胞膜完整，胞漿內(nèi)存在豐富的細(xì)胞器；胞核大而明顯，染色質(zhì)分布正常；細(xì)胞間連接較少，可見(jiàn)縫隙連接。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)陽(yáng)性細(xì)胞15.05±3.

8、92％。 結(jié)論：貼壁培養(yǎng)法是體外培養(yǎng)大鼠BMSCs的穩(wěn)定可靠的方法體系。第三代大鼠BMSCs具有生長(zhǎng)旺盛，增值能力強(qiáng)，分化程度低的特點(diǎn)；部分細(xì)胞可表達(dá)GFAP。 第二部分帕金森大鼠紋狀體提取液對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)作用 目的：探討帕金森大鼠紋狀體提取液在體外誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的可能。 方法：建立單側(cè)(右側(cè))帕金森病大鼠模型，取出雙側(cè)紋狀體分別制成正常紋狀體(正常側(cè))提取液與PD紋狀體(損傷側(cè))提

9、取液，制成不同濃度含紋狀體液的無(wú)血清培養(yǎng)基(誘導(dǎo)液)。收集幼年大鼠骨髓細(xì)胞，利用貼壁培養(yǎng)法純化擴(kuò)增獲取三代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MTT法分別檢測(cè)不同濃度紋狀體誘導(dǎo)液對(duì)BMSCs生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。取10％，60％，90％誘導(dǎo)液(共六組)培養(yǎng)BMSC，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞形態(tài)變化。于48小時(shí)后收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞表面神經(jīng)標(biāo)記物巢蛋白(Nestin)，神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron specialenolase，N

10、SE)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性率。 結(jié)果：相差顯微鏡下，部分細(xì)胞脫落，不再貼壁生長(zhǎng)，懸浮于培養(yǎng)液中。仍然貼壁的細(xì)胞失去原有圓形或梭形外觀，為不規(guī)則的多邊形或長(zhǎng)棒狀。有的細(xì)胞團(tuán)簇樣存在，向四周伸出輻射狀或長(zhǎng)或短的較粗的刺狀突起，還有的細(xì)胞單個(gè)薦在，胞體不規(guī)則，向周圍伸出單個(gè)或多個(gè)細(xì)長(zhǎng)的突起

11、樣結(jié)構(gòu)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，誘導(dǎo)后正常紋狀體誘導(dǎo)液10％濃度組NSE陽(yáng)性率為3.25±2.37％，GFAP陽(yáng)性率為48.44±29.47％；60％濃度組NSE陽(yáng)性率為20±8.62％，GFAP陽(yáng)性率為54.60±33.14％；兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PD紋狀體誘導(dǎo)液10％濃度組Nestin陽(yáng)性率為12.23±5.57％，GFAP陽(yáng)性率為55.56±30.23％；60％濃度組Nestin陽(yáng)性率為11.92±4.01％，GFAP陽(yáng)性率為55.

12、56±30.23％；兩組間亦沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各誘導(dǎo)組TH表達(dá)均為陰性。 結(jié)論：帕金森大鼠紋狀體提取液可以引起B(yǎng)MSCs形態(tài)學(xué)改變。與第三代BMSCs相比，誘導(dǎo)后GFAP陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多，同時(shí)出現(xiàn)NSE，Nestin陽(yáng)性細(xì)胞。 總論1．貼壁培養(yǎng)法是體外培養(yǎng)大鼠BMSCs的穩(wěn)定可靠的方法體系。第三代幼年大鼠BMSCs具有生長(zhǎng)旺盛，增值能力強(qiáng)，分化程度低的特點(diǎn)；部分細(xì)胞表達(dá)GFAP。 2．帕金森大鼠紋狀體提取液可以引起