1、背景與目的:中樞膽堿能系統(tǒng)被證明是影響學(xué)習(xí)和記憶的重要神經(jīng)系統(tǒng),已有資料表明,中樞乙酰膽堿(Ach)是學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì),主要證據(jù)是M-膽堿受體阻斷劑東莨菪堿能使大腦乙酰膽堿含量下降,并導(dǎo)致記憶障礙,而膽堿酶抑制劑(AchE)能增強(qiáng)記憶,到目前為止,治療老年性癡呆(AD)最有效的方法是膽堿酯酶制劑。它保護(hù)AD病人大腦中正在減少的Ach數(shù)量,改善AD病人記憶。
　　有關(guān)阿片類藥物成癮及其脫毒治療的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)阿片系統(tǒng)也參與和調(diào)制

2、學(xué)習(xí)記憶的過程.許多實(shí)驗(yàn)研究證明嗎啡降低額葉皮層、隔區(qū),海馬等部位細(xì)胞外Ach,其是,至少是部分抑制了中樞膽堿能神經(jīng)元活力而損害學(xué)習(xí)記憶。非選擇性阿片受體拮抗劑納絡(luò)酮能夠逆轉(zhuǎn)這種作用。納絡(luò)酮有利于記憶的保持、鞏固,微腦透析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),納絡(luò)酮能顯著增加海馬Ach的釋放,并呈劑量依賴性?？赡芡ǔＧ闆r下阿片系統(tǒng)對(duì)膽堿能神經(jīng)元有緊張性抑制作用,納絡(luò)酮解除了阿片肽對(duì)乙酰膽堿釋放的抑制。阿片系統(tǒng)和膽堿能系統(tǒng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶影響的機(jī)制尚不清楚。
　　乙

3、酰膽堿主要在神經(jīng)末梢合成,其合成的關(guān)鍵酶是膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)。ChAT在神經(jīng)元胞體合成,籍軸突運(yùn)輸運(yùn)送到神經(jīng)末梢的胞漿中。是否阿片系統(tǒng)對(duì)膽堿能神經(jīng)元胞體ChAT的合成或軸突ChAT的運(yùn)輸或神經(jīng)末梢ChAT活性存在影響,對(duì)神經(jīng)元突觸可塑性有何影響,目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　基于以上理論及資料,納洛酮改善東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙與其促進(jìn)乙酰膽堿在突觸的釋放有關(guān),本課題擬對(duì)其機(jī)制進(jìn)行一些探討:納洛酮是否對(duì)ChAT的合成或者運(yùn)輸有

4、影響,對(duì)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的神經(jīng)元突觸可塑性有何影響。從而為納洛酮改善老年性癡呆的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù),為進(jìn)一步闡明在學(xué)習(xí)記憶過程中阿片系統(tǒng)對(duì)膽堿能系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行有益的探索。同時(shí)比較納洛酮和加蘭他敏對(duì)東莨菪堿所致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善效果。
　　材料和方法:
　　實(shí)驗(yàn)一 Morris水迷宮工作記憶試驗(yàn)
　　2月齡SD大鼠56只按Morris水迷宮工作記憶試驗(yàn)方法訓(xùn)練,通過訓(xùn)練,每只大鼠表現(xiàn)穩(wěn)定,隨機(jī)分成4組(n=14):

5、正常對(duì)照組、東莨菪堿組、納洛酮治療組(東莨菪堿+納洛酮)和加蘭他敏治療組(東莨菪堿+加蘭他敏)。東莨菪堿按0.4mg/kg、納洛酮按3mg/kg,加蘭他敏按2 mg/kg,正常對(duì)照組予等量生理鹽水,均在實(shí)驗(yàn)前30分鐘腹腔給藥,然后開始水迷宮延緩性匹配作業(yè),記錄每只大鼠前后兩次逃避潛伏期。四組大鼠各取半數(shù)(n=7),1.5小時(shí)后重復(fù)Morris水迷宮工作記憶實(shí)驗(yàn),以觀察納洛酮治療效果持續(xù)時(shí)間。
　　采用免疫組化方法和計(jì)算機(jī)圖像分析技

6、術(shù)定量檢測(cè)大鼠海馬CA1、CA3區(qū)和前額葉皮層區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT),透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　實(shí)驗(yàn)二 Morris水迷宮參照記憶試驗(yàn)
　　1月齡 SD大鼠14只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、東莨菪堿模型組(n=7),東莨菪堿模型組大鼠每天皮下注射東莨菪堿2mg/kg,一天兩次,正常對(duì)照組予等量生理鹽水,連續(xù)21天。然后按Morris水迷宮參照記憶試驗(yàn)方法,觀察定位航行、空間探索和可見平臺(tái)實(shí)驗(yàn)。
　

7、　采用Nissl染色法進(jìn)行海馬CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù),常規(guī)蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色進(jìn)行海馬CA1、CA3區(qū)組織病理學(xué)觀察,透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一結(jié)果:
　　四組大鼠空間工作記憶結(jié)果,前后逃避潛伏期比較:正常組呈極顯著性差異(p<0.001),東莨菪堿組無差異(P>0.05),說明工作記憶受損害;納洛酮治療組呈顯著性差異(p<0.05

8、),說明東莨菪堿所致工作記憶損害得到明顯恢復(fù);加蘭他敏治療組仍無差異(P>0.05),說明受到損害的工作記憶并無改善。四組Trial1逃避潛伏期比較:其他三組與正常組比較(Dunnett T test),均無顯著性差異,組間最大差異(LSD檢測(cè))比較,東莨菪堿組、加蘭他敏治療組顯著小于正常組(p<0.05),東莨菪堿組、納洛酮治療組和加蘭他敏治療組間無差異。
　　膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的灰度、陽(yáng)性單位數(shù)、陽(yáng)性單位/面積在四組大

9、鼠海馬 CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞和前額葉皮層無顯著性差異(P>0.05);其他三組與正常組比較(Dunnett T test),均無顯著性差異;組間最大差異(LSD檢測(cè))比較亦無顯著性差異。說明各組CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞、前額葉皮層神經(jīng)元ChAT量、ChAT表達(dá)陽(yáng)性數(shù)目及密度無差別。
　　四組大鼠海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)的變化:四組大鼠錐體細(xì)胞胞體細(xì)胞核及細(xì)胞器正常,但CA1區(qū)神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)有明顯變化,正常組突觸間隙清晰,囊泡大

10、小均一,并向突觸前膜聚集,突觸后致密物質(zhì)均勻,致密。東莨菪堿組突觸前后膜模糊,融合,間隙不清;囊泡明顯大小不一,突觸前膜處聚集明顯,密度增加,遠(yuǎn)隔處囊泡大而稀疏,突觸后致密物質(zhì)不均、模糊,邊界朦朧。納絡(luò)酮組,突觸間隙清楚,囊泡大小均一,稀疏,向突觸前膜聚集,突觸后致密物質(zhì)均勻,邊界整齊清楚。加蘭他敏組,突觸間隙清楚,但前后膜模糊似有融合;囊泡大小欠均一,分布彌散,無明顯突觸前膜聚集現(xiàn)象,突觸后致密物質(zhì)欠均勻,邊界欠清晰。四組大鼠CA1區(qū)

11、神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)明顯改變提示突觸可塑性變化,與行為學(xué)變化相一致。
　　納洛酮治療效果持續(xù)時(shí)間結(jié)果:四組(n=7)大鼠1.5小時(shí)后重復(fù)Morris水迷宮工作記憶實(shí)驗(yàn),前后逃避潛伏期比較:納洛酮治療組差異無顯著性(P>0.05),同東莨菪堿組、加蘭他敏治療組,說明1.5個(gè)小時(shí)后納洛酮改善工作記憶的作用消失。
　　實(shí)驗(yàn)二結(jié)果:
　　定位航行實(shí)驗(yàn):兩組大鼠成績(jī)均隨學(xué)習(xí)次數(shù)的增加每天呈進(jìn)步趨勢(shì),東莨菪堿組逃避潛伏期在第3天大于

12、正常組,差異呈顯著性(p<0.05),但第4、5天成績(jī)與正常組無顯著性差異,第5天幾乎完全相同。運(yùn)動(dòng)軌跡在四個(gè)象限隨機(jī)分布相似,表明其搜索隱匿平臺(tái)策略相似。
　　正常組學(xué)習(xí)記憶情況有明顯的規(guī)律性,隨學(xué)習(xí)次數(shù)的增加,成績(jī)也明顯好轉(zhuǎn),每天均有明顯進(jìn)步,東莨菪堿組并不像正常組一樣穩(wěn)定,但仍呈好轉(zhuǎn)趨勢(shì),并在第5天與正常組一致。
　　說明東莨菪堿對(duì)大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)成績(jī)有輕度損害,但影響不大。
　　空間探索實(shí)驗(yàn):兩組間無顯著性差異

13、(P>0.05)。均在前4天記憶保持較好,第5天突然下降。說明東莨菪堿對(duì)長(zhǎng)時(shí)記憶無影響。
　　可見平臺(tái)實(shí)驗(yàn):可見平臺(tái)逃避潛伏期無顯著性差異(P>0.05)。說明東莨菪堿對(duì)大鼠視覺、感覺、運(yùn)動(dòng)及動(dòng)機(jī)無影響。
　　兩組大鼠Nissl染色錐體細(xì)胞數(shù)比較,錐體細(xì)胞數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。
　　HE染色東莨菪堿組海馬CA1、CA3區(qū)未見組織病理學(xué)改變。
　　兩組大鼠超微結(jié)構(gòu):錐體細(xì)胞核及細(xì)胞器無差異,但CA1區(qū)神經(jīng)

14、元突觸有輕微變化。正常組突觸間隙清楚,囊泡大小均一,豐富,分布均勻,突觸后致密物質(zhì)濃密。東莨菪堿組突觸間隙清晰,囊泡大小均一,但數(shù)量較少,在突觸前膜處稀疏聚集,突觸后致密物質(zhì)較淺淡。CA1區(qū)神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)改變提示突觸可塑性有輕微變化,與行為學(xué)變化一致。
　　結(jié)論:
　　1.東莨菪堿一次性給藥能顯著損害大鼠空間工作記憶,納絡(luò)酮明顯改善該損害,其機(jī)制可能并非是納絡(luò)酮增加ChAT活性,而是促進(jìn)神經(jīng)元突觸囊泡Ach向突觸間隙大量