1、Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)是一種以骨骼肌進行性變性、壞死為主要病理特征的X連鎖隱性遺傳性肌肉疾病，在出生活男嬰中發(fā)病率為1／3500。目前已知DMD是由編碼抗肌萎縮蛋(dystrophin)基因突變導致該蛋白缺失而引起發(fā)病的。患兒一般3～5歲開始出現(xiàn)臨床癥狀，12歲后喪失行走能力，常于20歲左右死于呼吸／循環(huán)衰竭。 本研究擬體外構建帶有microdystrop

2、hin的重組桿狀病毒、擴增、純化；體外分離、培養(yǎng)、鑒定DMD動物模型鼠脂肪干細胞；體外重組桿狀病毒轉導模型鼠脂肪干細胞并鑒定細胞活性、增殖能力、成肌分化潛能；經基因修飾后的自體脂肪干細胞左心房注射移植DMD模型鼠；檢測細胞移植后在模型鼠體內分布及表達microdystrophin情況，為今后臨床上建立自體脂肪干細胞基因修飾后移植治療DMD模式提供實驗依據和理論基礎。 材料和方法： 1.試驗材料 1.1 試驗動物

3、 6～10周齡mdx鼠(20～30g)共10只，隨機分2組；8～10周齡dko鼠(10～20g)共5只，隨機分2組： (1)mdx鼠對照組(4只)，dko鼠對照組(2只)：給予0.15 mL PBS左心房注射； (2)經microdys基因修飾后的自體脂肪干細胞左心房移植mdx鼠(6只)，dko鼠(3只)。移植后的1W為觀察點。 1.2 試驗試劑與器材(略) 2.試驗方法 2.1帶有綠色熒光蛋白的桿狀病

4、毒載體(Bv-GFP)、腺病毒載體(Av-GFP)、腺相關病毒載體(AAv-GFP)、質粒載體(pGFP)擴增，濃度鑒定Bv-GFP由華中農業(yè)大學微生物國家重點實驗室構建、惠贈。Bv-GFP轉導sf9細胞擴增，極度稀釋法測定擴增后的重組桿狀病毒滴度；Av-GFP于-80℃凍存，室溫復蘇后將其轉導293細胞以擴增，用極度稀釋法測定擴增后的重組腺病毒滴度；AAV2-GFP(滴度為1×1012v．g／mL)購于本元正陽基因有限公司；pGFP購

5、于Clontech公司，經大腸桿菌擴增的pGFP，用紫外分光光度儀測其濃度。 2.2 dko鼠鑒定 尾靜脈采血，提DNA基因鑒定；脛前肌冰凍切片，免疫組化鑒定。 2.3 DMD模型鼠脂肪干細胞分離、培養(yǎng)、鑒定 采用差速貼壁法分離、擴增及純化mdx鼠及dko鼠脂肪干細胞(mouse adipose derived stem cells，mASCs)，并進行表面抗原檢測和成脂、成骨分化能力鑒定，將形態(tài)一致的P

6、5～8代mASCs進行后續(xù)的試驗。 人骨髓間充質干細胞(human bone malTow derived mesenchymal stem cells，hMSCs)，SD大鼠成肌細胞(rat myoblast，rmyoblast)、脂肪干細胞(rat adipose derived stem cells,rASCs)，mdx鼠骨髓間充質干細胞(mouse bone marrow derived mesenehymal stem

7、 cells,mMSCs)、成肌細胞(mouse myoblast，mmyoblast)、羊水干細胞(mouse amniotic fluid derived stem cells，mAFSs)、神經干細胞(mouse neuron derived stem cells,mNSCs)用上述類似的方法分離、培養(yǎng)、鑒定。 2.4 基因載體Bv-GFP、Av-GFP、AAv-GFP、pGFP轉導人骨髓間充質干細胞 Bv-GFP

8、、AV-GFP、AAv-GFP在MOI值為200v．g／cell、孵育溫度為25℃、孵育時間為4 h的條件下轉導hMSCs；采用脂質體2000介導質粒pGFP轉染hMSCs。流式細胞儀(flow cytometry,FCM)檢測各基因載體對hMSCs的轉導效率。 2.5 Bv-GFP轉導mdx鼠不同組織干細胞 Bv-GFP在MOI值為200v．g／cell、孵育溫度為25℃、孵育時間為4 h的條件下轉導mdx鼠mASCs

9、、mMSCs、mmyoblast、mAFSs、mNSCs，流式細胞儀檢測Bv-GFP對各細胞的轉導效率。 2.6帶有microdystrophin基因的重組桿狀病毒(Bv-mierodys)轉導小鼠脂肪干細胞及鑒定 Bv-microdys(滴度1×1013v．g／mL)由華中農業(yè)大學微生物國家重點實驗室構建、惠贈。Bv-microdys在MOI值為1000 v．g／cell、孵育溫度為25℃、孵育時間為4 h的條件下轉導

10、mASCs，應用細胞間接免疫熒光、RT-PCR鑒定microdystrophin在mASCs中的表達。苔盼藍染色進一步檢測經Bv-microdys基因修飾的mASCs細胞活性。 2.7 Bv-microdys轉導大鼠脂肪干細胞后對其成肌分化潛能的影響 將經Bv-microdys基因修飾的rASCs及對照組細胞與rmyoblast在Transwell小室共培養(yǎng)，在規(guī)定時間點分別進行細胞免疫熒光及RT-PCR檢測MyoD、d

11、evMHC的表達。 2.8 microdys-mASCs遷移能力檢測 應用Transwell小室細胞遷移試驗，分別檢測人臍帶靜脈內皮細胞、人臍帶靜脈內皮細胞條件培養(yǎng)基、TNF-β對microdys-mASCs遷移能力的影響。 2.9 microdys-mASCs移植前Hochest33258標記 于移植前24 h將microdys-mASCs經Hochest33258孵育半小時，并檢測胞核標記情況。

12、 2.10脂肪干細胞左心房移植DMD模型鼠 經人臍帶靜脈內皮細胞條件培養(yǎng)基孵育6 h后的microdys-mASCs左心房移植DMD模型鼠。 2.11 microdys-mASCs心臟移植后在模型鼠體內分布及表達microdystrophin情況 移植1W后取移植鼠和對照鼠脛前肌、膈肌、心肌，免疫組化檢測microdystrophin表達情況。 2.12統(tǒng)計學分析 所有統(tǒng)計學數(shù)據采用SPSS13

13、.0進行t檢驗和單因素方差分析，顯著性檢驗水準為α=0.05。 結論： 1.重組桿狀病毒對小鼠不同組織來源干細胞轉導效率有明顯差別，其對于人骨髓間充質干細胞的轉導效率高于腺病毒、腺相關病毒、質粒載體，且對細胞無毒性作用。 2.經帶有microdystrophin重組桿狀病毒基因修飾后的大鼠脂肪干細胞保持成肌分化潛能。 3.經人臍帶靜脈內皮細胞條件培養(yǎng)基孵育的mdx小鼠脂肪干細胞遷移能力增強。 4.