1、研究背景： 雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide，TR)，又稱雷公藤內(nèi)酯、雷公藤甲素、PG490，是從衛(wèi)矛科雷公藤屬植物中成功分離提純出的環(huán)氧二萜化合物。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)TR具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制、抗生育作用等多種生物活性!進(jìn)一步對(duì)該藥的探索發(fā)現(xiàn)TR發(fā)揮生物活性的主要作用機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；在婦產(chǎn)科領(lǐng)域，多年來一直將雷公藤提取出的混合制劑“雷公藤多甙”在內(nèi)科使用中出現(xiàn)的女性閉經(jīng)與不孕這一性腺抑制現(xiàn)象歸為毒副作用，回避多于探索。直至

2、近期，國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)在婦科子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤等患者中使用雷公藤提取物得到良好治療效果，使人們開始認(rèn)識(shí)到雷公藤內(nèi)酯醇作為雌激素拮抗劑和免疫調(diào)節(jié)劑可推廣使用到婦科臨床并治療上述雌激素依賴性疾病。但是TR對(duì)女性生殖系統(tǒng)，尤其是對(duì)卵巢卵泡發(fā)育的影響及其作用機(jī)制尚未闡明。TR對(duì)女性性腺活動(dòng)抑制的程度及其是否導(dǎo)致卵巢生殖潛能永久性損害等重要問題亟待研究。 研究目的： 通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究不同劑量TR處理后大鼠動(dòng)情周期和卵巢組織

3、學(xué)的改變，客觀計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡數(shù)目變化和卵泡凋亡率，探討TR的卵巢抑制機(jī)制；并且設(shè)置停藥恢復(fù)觀察組，進(jìn)一步研究藥物作用的可逆性。 方法： 選取性成熟、有規(guī)律動(dòng)情周期的健康雌性SD大鼠60只，隨機(jī)分為以下6組(每組10只)：空白對(duì)照組無用藥處理；安慰劑對(duì)照組每日給予蒸餾水灌胃(含0.06％溶媒二甲基亞砜)；TR高劑量組、TR低劑量組每日分別灌喂120 μg／kg／d、60 μ g／kg／d的TR(0.06％二甲基亞砜溶解后配制

4、)；以上各組處理期共35天；另外設(shè)立高、低劑量停藥恢復(fù)組，此2組大鼠分別給予前述35天TR高、低劑量灌胃處理后，繼續(xù)停藥飼養(yǎng)30天，觀察處理期后有無藥物延遲作用以及藥物的影響能否恢復(fù)。整個(gè)觀察期間，各組大鼠每日陰道涂片觀察動(dòng)情周期；每隔4天測(cè)量體重以調(diào)整用藥劑量并觀察動(dòng)物生長(zhǎng)情況。觀察期末，麻醉手術(shù)、活體取材大鼠左側(cè)卵巢后處死動(dòng)物，卵巢即刻固定，石蠟包埋后連續(xù)切片進(jìn)行組織學(xué)研究，分類計(jì)數(shù)各組大鼠卵巢切片中原始卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡的數(shù)目

5、進(jìn)行組間比較；并用TUNEL(脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的DNA缺口末端標(biāo)記)法對(duì)卵巢切片中的凋亡細(xì)胞進(jìn)行原位標(biāo)記，顯微鏡下辨認(rèn)標(biāo)記的凋亡卵泡(出現(xiàn)卵母細(xì)胞凋亡著色或10％以上的顆粒細(xì)胞凋亡著色的卵泡)，也按原始卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡三個(gè)不同發(fā)育階段分類計(jì)數(shù)。 結(jié)果： 1.TR作用下大鼠生長(zhǎng)狀況未受影響 實(shí)驗(yàn)全程大鼠基本生活狀態(tài)良好，未出現(xiàn)病、死現(xiàn)象；處理前、后各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組相比，本研究

6、未發(fā)現(xiàn)TR處理后大鼠生長(zhǎng)受限。2.TR作用下大鼠動(dòng)情周期發(fā)生改變高劑量組大鼠出現(xiàn)明顯的動(dòng)情周期延長(zhǎng)(動(dòng)情周期平均5.674±1.45天)，與低劑量組、安慰劑對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.001、<0.001)；而且此組大鼠中44.5％的個(gè)體出現(xiàn)過動(dòng)情周期缺失，而其它各組僅有不到18％的個(gè)體會(huì)出現(xiàn)這種比較明顯的動(dòng)情周期停滯現(xiàn)象；但停藥觀察期，高劑量停藥恢復(fù)組大鼠的動(dòng)情周期平均水平較用藥期顯著下降(4.174±0.59)，停藥

7、前后相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.010)，而且該組停藥期動(dòng)情周期長(zhǎng)短與對(duì)照組相比差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果顯示恢復(fù)期該組大鼠動(dòng)情周期回復(fù)到正常水平。低劑量組大鼠動(dòng)情周期則未受明顯抑制，其動(dòng)情周期長(zhǎng)短與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.組織形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TR處理組大鼠卵巢中次級(jí)卵泡分布改變 高劑量組和低劑量組大鼠卵巢內(nèi)次級(jí)卵泡的計(jì)數(shù)較對(duì)照組均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而各組間原始卵泡和竇卵泡計(jì)數(shù)的差異則無統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)意義；進(jìn)一步比較高、低劑量組間次級(jí)卵泡的計(jì)數(shù)水平雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，然而從所得數(shù)值看出，低劑量組次級(jí)卵泡均數(shù)(13.9±2.33)要略高于高劑量組(12.0±1.55)；高、低劑量停藥恢復(fù)組各階段的卵泡計(jì)數(shù)則與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。除此以外，各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)研究未發(fā)現(xiàn)卵巢壞死、變性等受損表現(xiàn)。 4.TR處理組大鼠卵巢中次級(jí)卵泡凋亡率明顯增高 高劑量組和低劑量組大鼠均出現(xiàn)次級(jí)卵泡凋亡率的明顯增加，分別為：31％、3

9、2％，與安慰劑和空白對(duì)照組(凋亡率分別為12％、13％)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；而各組間原始卵泡和竇卵泡凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)過停藥恢復(fù)期，低劑量停藥恢復(fù)組大鼠卵巢內(nèi)次級(jí)卵泡的凋亡率(21％)與低劑量處理組的凋亡率(32％)相比顯著降低(p=0.043)，而與對(duì)照組相比則凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；高劑量停藥恢復(fù)組的次級(jí)卵泡凋亡率為26％，與高劑量處理組的凋亡率(31％)相比差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 結(jié)果顯示：不同劑量

10、的TR都可促進(jìn)卵巢內(nèi)次級(jí)卵泡細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致次級(jí)卵泡發(fā)育停滯而在卵巢中堆積，但尚未出現(xiàn)大量卵泡耗竭。低劑量組停藥后這種改變能很快恢復(fù)；而高劑量TR對(duì)卵巢抑制和誘導(dǎo)次級(jí)卵泡凋亡的作用似乎更強(qiáng)，經(jīng)過停藥觀察期，高劑量恢復(fù)組動(dòng)情周期長(zhǎng)短已恢復(fù)到對(duì)照組水平，但次級(jí)卵泡凋亡率雖呈現(xiàn)下降趨勢(shì)卻未完全恢復(fù)。 結(jié)論： 1.雷公藤內(nèi)酯醇抑制雌性大鼠卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育并導(dǎo)致動(dòng)情周期延長(zhǎng)；這種抑制的主要環(huán)節(jié)在于TR可通過誘導(dǎo)大鼠卵巢內(nèi)次級(jí)卵泡細(xì)胞