1、由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）引起的豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種高度傳染性疾病，對(duì)世界各國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，主要表現(xiàn)為仔豬的呼吸道疾病和妊娠母豬的繁殖障礙。PRRSV具有很強(qiáng)的變異性并且在豬體內(nèi)持續(xù)性感染，現(xiàn)有的疫苗無(wú)法完全控制該疾病的流行，因此遺傳抗性育種是控制該病流行的新的研究方向。已有研究表明不同豬品種之間存在PRRSV抗性的差異，姜曲海豬抗性顯著高于定遠(yuǎn)豬，但機(jī)制不明。本文對(duì)姜曲海豬、定遠(yuǎn)豬肺泡巨噬細(xì)

2、胞(PAM)接種PRRSV,12h后檢測(cè)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抗原遞呈過(guò)程中起重要作用的SLA-DRB1在姜曲海豬中高表達(dá)，而定遠(yuǎn)豬中表達(dá)量甚低。在此基礎(chǔ)上，采用RNAi技術(shù)研究了SLA-DRB1基因敲減后PAMs中PRRSV載量的差異;以及SLA-DRB1上游轉(zhuǎn)錄因子CIITA和RFX5在PRRSV攻毒前后mRNA表達(dá)水平的差異;并以大白姜曲海雜交攻毒群體及其橫交一代攻毒群體為研究對(duì)象，分析了SLA-DRB1基因多態(tài)性與豬PRRSV易感性的相

3、關(guān)性，旨在探索豬對(duì)PRRSV抗性差異的潛在機(jī)制。主要試驗(yàn)內(nèi)容包括以下四部分:
　　1.姜曲海豬和定遠(yuǎn)豬PAMs中感染PRRSV前后SLA-DRB1基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平
　　本研究采用肺泡灌流的方法獲得姜曲海豬和定遠(yuǎn)豬的肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)，純化后體外感染PRRSVNJGC珠，在感染PRRSV后6h和12h收集細(xì)胞，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PRRSV-N基因、SLA-DRB1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，攻毒后，定遠(yuǎn)

4、豬PAM中PRRSV-N基因mRNA的表達(dá)水平顯著性高于姜曲海豬(P＜0.05)，而SLA-DRB1基因mRNA表達(dá)水平均顯著低于姜曲海豬（P＜0.05），同時(shí)定遠(yuǎn)豬PAM中SLA-DRB1基因mRNA表達(dá)水平在攻毒前亦顯著低于姜曲海豬(P＜0.05)。
　　2.SLA-DRB1基因敲減的PAM中PRRSV裁量
　　為了進(jìn)一步了解SLA-DRB1基因與PRRSV之間的關(guān)系，本研究采用RNAi技術(shù)抑制了SLA-DRB1基因在P

5、AM中的表達(dá)，PRRSV感染SLA-DRB1基因表達(dá)抑制后的PAM，12h后收集細(xì)胞，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)5LA-DRB1基因和PRRSV-N基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示SLA-DRB1基因的表達(dá)受到抑制后，接種PRRSV后12h的PAM中PRRSV-N基因的表達(dá)量顯著性上升，即PRRSV的載量顯著增加。
　　3.SLA-DRB1基因上游轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平
　　為進(jìn)一步探究SLA-DRB1在不同抗性豬差異表達(dá)的機(jī)制，對(duì)該

6、基因上游起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子CIITA和RFX5進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CIITA基因和RFX5基因在接種PRRSV后6h和12h的姜曲海豬和定遠(yuǎn)豬PAM中的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種PRRSV后6h和12 h CIITA基因和RFX5基因在姜曲海豬中的表達(dá)水平均高于定遠(yuǎn)豬，且在攻毒后表達(dá)水平均高于攻毒前表達(dá)水平，其表達(dá)趨勢(shì)與SLA-DRB1相同。
　　4.豬SLA-DRB1基因單核苷酸多態(tài)性與PRRSV易感性的

7、關(guān)聯(lián)分析
　　為探索豬SLA-DRB1基因單核苷酸多態(tài)性與PRRSV易感性的關(guān)系，對(duì)豬SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)和外顯子3進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，篩選多態(tài)性位點(diǎn)，分析其與PRRSV易感性的相關(guān)性。測(cè)序共發(fā)現(xiàn)了8個(gè)單堿基突變位點(diǎn)，分別是啟動(dòng)子序列上-12bp處的C/A突變和-27 bp、-29 bp、-56 bp處的C/T突變以及在外顯子3上17 bp處的G/A突變、95 bp處的C/T突變、137 bp、232 bp處的G/C突變。針對(duì)

8、外顯子3g.232 G/C突變建立PCR-RFLP方法，在所檢測(cè)的7個(gè)群體共315個(gè)個(gè)體中該突變位點(diǎn)只檢測(cè)到GG型和GC型兩種基因型，在大白豬中只發(fā)現(xiàn)了GG型，大白姜曲海豬群體及橫交一代雜交群體中以GC型(0.57/0.62)居多，GG型(0.43/0.38)次之，其他群體均以GG型居多，GC型次之。對(duì)該位點(diǎn)大白姜曲海群體和橫交一代雜交群體不同基因型與體重及PRRSV載量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)不同基因型豬血液中PRRSV載量差異不顯著

9、(P＞0.05），大白姜曲海群體中不同基因型在體重變化差異也不顯著(P＞0.05)。針對(duì)啟動(dòng)子區(qū)的g.-56 C/T突變建立CRS-PCR-RFLP方法，共檢測(cè)了7個(gè)群體共315個(gè)個(gè)體，在橫交一代群體及長(zhǎng)白豬和定遠(yuǎn)豬中均檢測(cè)到3種基因型，均以CC型(0.43/0.62/0.46)居多，TC型(0.40/0.30/0.36)次之，TT型(0.17/0.08/0.18)最少，在大白姜曲海群體中只檢測(cè)到CC型(0.53)和TC型(0.47)兩

10、種基因型，其他群體只檢測(cè)到CC型。分析該位點(diǎn)與攻毒后橫交一代群體豬體重變化的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，CC型個(gè)體的平均體重極顯著性高于TT型和TC型(P＜0.01)，分析該位點(diǎn)與豬PRRSV易感性的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)橫交一代群體中CC基因型的PRRSV病毒載量在接毒后各時(shí)間段均不同程度的低于TT基因型和TC基因型，并于4d、7d和14d時(shí)達(dá)到顯著性差異(P＜0.05)。針對(duì)啟動(dòng)子區(qū)的另外3個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)橫交一代群體采用直接測(cè)序的方法進(jìn)行分型，均檢測(cè)到了三種基因

11、型，-29 bp處以TC型居多，TT型次之，CC型最少;-27 bp處以TC型居多，CC型次之，TT型最少;-12 bp處以CC型最多，AC型次之，AA型最少。對(duì)-29 bp處的突變與PRRSV相對(duì)表達(dá)量及體重進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在接種病毒后7、11、14、21 d PRRSV相對(duì)表達(dá)量CC型顯著(P＜0.05)低于TT型和TC型而體重相關(guān)性分析得到CC型個(gè)體在不同時(shí)間點(diǎn)的平均體重最高，于接毒后14d、21 d、28 d、42 d顯著(

12、P＜0.05)高于TT型和TC型。對(duì)-27 bp處的突變與PRRSV相對(duì)表達(dá)量及體重進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在接種病毒后4d、7d、11d、14 d、21d和42dPRRSV相對(duì)表達(dá)量TT型顯著（P＜0.05）低于CC型和TC型;而體重相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TT型個(gè)體在不同時(shí)間點(diǎn)的平均體重最高，于接毒后21d、28d、42d顯著(P＜0.05)高于CC型和TC型，于接毒后11d、14d、35d顯著(P＜0.05）高于TC型。對(duì)-12 bp處的突變與