1、惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類生命健康，已成為人類最主要的致死疾病之一。據(jù)全國腫瘤防治研究辦公室的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，我國每年新發(fā)癌癥病例為350萬，因癌癥死亡的有250萬。化學(xué)療法是目前治療癌癥的重要手段之一，但是臨床上的化療藥物在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)也損傷了機(jī)體正常細(xì)胞的功能，導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，降低了患者的生存質(zhì)量。此外，癌細(xì)胞對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，常常導(dǎo)致化療失敗。因此，迫切需要尋找高效、低毒的新型腫瘤治療藥物。
　　大量研究表明，多糖具有廣

2、泛的藥理學(xué)活性，包括抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老等。其中，多糖的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性研究受到越來越多的關(guān)注。多糖主要從兩個(gè)方面發(fā)揮抗腫瘤作用:作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑激活機(jī)體的免疫反應(yīng)間接發(fā)揮抗腫瘤活性;通過引起細(xì)胞應(yīng)激，調(diào)控腫瘤細(xì)胞中癌基因表達(dá)等誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡、細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮直接抗腫瘤作用。
　　黑根霉Rhizopus nigricans是一種接合菌門絲狀真菌，具有優(yōu)異的生物轉(zhuǎn)化功能，被廣泛應(yīng)

3、用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。研究發(fā)現(xiàn)，通過液體發(fā)酵獲得的黑根霉菌絲體中含有大量活性多糖組分，具有良好的藥理活性。本文以實(shí)驗(yàn)室分離保藏的一株黑根霉為材料，從其液體發(fā)酵菌絲中分離純化活性多糖組分，研究其結(jié)構(gòu)特征、抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性。以上研究旨在闡明黑根霉菌絲體多糖抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性的分子機(jī)制，為將其開發(fā)成為一種治療或輔助治療癌癥的藥物奠定基礎(chǔ)。
　　1.黑根霉菌絲體多糖的制備和結(jié)構(gòu)表征
　　采用水熱浸提、乙醇沉淀、Sevag

4、脫蛋白、D301R大孔樹脂脫色，從黑根霉菌絲體中獲得粗多糖。經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱層析，從粗多糖中分離獲得黑根霉菌絲體多糖RPS，RPS的單糖組成和摩爾比為甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶巖藻糖=5.1∶1.0∶1.6∶92.2∶1.3∶2.3。另外，采用DEAE-Sepharos FastFlow陰離子交換凝膠層析和Sephacryl S-500 HR分子篩凝膠層析從粗多糖中分離純化獲得一種均一的水溶性非淀粉

5、多糖，命名為RPS-1。高效尺寸排阻色譜聯(lián)用多角度激光散射分析表明RPS-1的重均分子量為1.617×107 g/mol，多分散系數(shù)為1.332，均方根旋轉(zhuǎn)半徑為24.2 nm。紅外光譜結(jié)果顯示RPS-1具有多糖的特征吸收峰。PMP柱前衍生化方法分析RPS-1的單糖組成，結(jié)果顯示RPS-1只含有葡萄糖一種單糖。甲基化分析結(jié)果表明，RPS-1糖鏈中含有α-Glcp-(1→、→4)-α-Glcp-（1→和→4，6）-α-Glcp-（1→三種

6、連接方式，摩爾比例為6.9∶86.1∶6.9。1H NMR核磁共振譜圖的異頭質(zhì)子信號(hào)區(qū)域顯示兩個(gè)共振峰，δ5.35 ppm和4.92
　　ppm分別歸屬為→4）-α-Glcp-（1→和α-Glcp-(1→的異頭碳質(zhì)子信號(hào)。13C NMR核磁共振譜圖中，δ99.86 ppm為→4)-α-Glcp-（1→的C-1共振峰，且位于α-型糖苷異頭碳的共振信號(hào)范圍內(nèi)。δ76.95 ppm為發(fā)生取代的C-4共振峰，δ60.58 ppm是葡萄糖殘

7、基的未取代的C-6共振峰，δ69.43 ppm是葡萄糖殘基發(fā)生取代的C-6共振峰。根據(jù)以上結(jié)果我們推斷，RPS-1是以→4）-α-D-Glcp（1→為主鏈并在其O-6位產(chǎn)生支鏈的非淀粉葡聚糖，平均每14.5個(gè)葡萄糖出現(xiàn)1個(gè)→4，6)-α-Glcp-(1→殘基。
　　2.黑根霉菌絲體多糖RPS的抗腫瘤活性研究
　　多糖具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)和多樣的生物活性，可以在體外直接作用于腫瘤細(xì)胞，干擾細(xì)胞的新陳代謝、抑制其分裂增殖。本文研究

8、了RPS對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞的抗腫瘤活性，并初步探討了其可能的作用機(jī)制。MTT結(jié)果顯示，RPS處理12h、24、48h可以顯著抑制BGC-823細(xì)胞生長。集落克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，600μg/ml的RPS可以顯著抑制BGC-823細(xì)胞集落形成，抑制率為70％。Hoechst33258染色、AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，RPS誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞發(fā)生凋亡性細(xì)胞死亡。細(xì)胞周期分布檢測(cè)結(jié)果顯示

9、，RPS可以阻滯腫瘤細(xì)胞于G2/M期。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，RPS可以誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞線粒體膜電位的下降，提高細(xì)胞內(nèi)活性氧含量。Caspase-9是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵蛋白酶，位于線粒體通路中caspase瀑布式級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)的頂端，600μg/ml濃度的RPS處理組的caspase-9活性是對(duì)照組的1.72倍。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，RPS處理12h后，Bcl-2的mRNA的表達(dá)量隨著RPS濃度的升高不斷降低，然而Bax的mRNA表達(dá)量隨

10、著RPS濃度的升高不斷增加。這些結(jié)果表明，RPS通過線粒體途徑誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細(xì)胞發(fā)生凋亡。我們還發(fā)現(xiàn)，RPS可以提高BGC-823細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，上調(diào)GRP78、ATF6、CHOP和spliced-XBP1的mRNA表達(dá)水平，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能也參與了RPS誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡。
　　3.黑根霉菌絲體多糖RPS-1的免疫調(diào)節(jié)活性研究
　　巨噬細(xì)胞是最重要的吞噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞之一，在機(jī)體免疫響應(yīng)中發(fā)揮

11、重要作用。因此，本文選擇小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為材料，研究RPS-1的免疫調(diào)節(jié)活性。MTT檢測(cè)結(jié)果表明，RPS-1在25-800μg/ml濃度范圍內(nèi)對(duì)巨噬細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。采用Griess法和ELISA分別測(cè)定NO和TNF-α的含量，結(jié)果表明RPS-1能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO和TNF-α，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明RPS-1可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力。PMB可以特異性和內(nèi)毒素結(jié)合，阻斷其對(duì)巨噬細(xì)胞的刺激作用。PMB預(yù)處理不影響RPS-

12、1刺激巨噬細(xì)胞分泌NO和TNF-α，說明RPS-1中不含內(nèi)毒素污染。為了探明RPS-1激活巨噬細(xì)胞的信號(hào)通路和分子機(jī)制，我們采用免疫熒光染色、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和westem blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NF-κB、MAPK、Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RPS-1可以時(shí)間依賴性的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)I Bα的降解和NF-κB p65的核移位，濃度依賴性的提高NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。使用NF-κB通路特異性抑制劑BAY11-7082(10μM)

13、幾乎完全抑制RPS-1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌NO和TNF-α，表明NF-κB是參與RPS-1激活巨噬細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子。我們還發(fā)現(xiàn)，RPS-1提高了p38、JNK、ERK和Akt的磷酸化水平。MAPK通路抑制劑PD98059（30μM）、SP600125(20μM)以及PI3K/Akt通路抑制劑LY294002(50μM)可以不同程度的抑制RPS-1誘導(dǎo)的NO和TNF-α分泌，然而p38通路抑制劑SB203580(10μM)對(duì)RPS-1誘導(dǎo)的

14、NO分泌沒有影響。在不同的細(xì)胞類型和刺激因素下，MAPK通路和PI3K/Akt通路之間存在著復(fù)雜的相互作用。我們發(fā)現(xiàn)，MAPK抑制劑預(yù)處理巨噬細(xì)胞30min后，RPS-1誘導(dǎo)的Akt磷酸化水平出現(xiàn)不同程度的下降，PI3K/Akt抑制劑LY294002預(yù)處理可以明顯降低JNK的磷酸化水平，但是對(duì)p38和ERK的磷酸化水平?jīng)]有明顯的影響，表明p-JNK和p-Akt在RPS-1激活巨噬細(xì)胞過程中存在著交互作用。RPS-1可以提高CT26結(jié)腸癌

15、荷瘤小鼠的免疫器官指數(shù)、血清細(xì)胞因子含量和CD8+T淋巴細(xì)胞比例，抑制腫瘤生長，和5-FU聯(lián)用還具有減毒增效的作用。
　　綜上所述，黑根霉菌絲體多糖RPS通過誘導(dǎo)線粒體途徑細(xì)胞凋亡和G2/M期阻滯抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖;黑根霉菌絲體多糖RPS-1是以→4）-α-D-Glcp（1→為主鏈并在其O-6位產(chǎn)生支鏈的非淀粉葡聚糖，可以通過NF-κB、MAPK和PI3K/Akt通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO和TNF-α，提高CT26結(jié)