1、研究背景:變態(tài)反應(yīng)疾病(過敏性疾病)被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問題，世界各國變態(tài)反應(yīng)性疾病的總發(fā)病率高達10-30％，此類疾病包括過敏性哮喘(哮喘)、過敏性鼻炎等，是臨床上的常見病、多發(fā)病。近些年來其發(fā)病率在逐步增高。在引起過敏性疾病眾多吸入性變應(yīng)原中，塵螨是導(dǎo)致呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的最重要因素。與過敏性疾病有關(guān)的塵螨主要為屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus，Derp)和粉塵螨(Derma

2、tophagoidesfarinae，Derf)。它們喜好在溫暖、潮濕環(huán)境中繁衍，以人或動物的皮屑、指甲及毛發(fā)為主要食物，多藏匿于床褥、枕頭、地毯、衣服、毛絨玩具或家具內(nèi)。塵螨個體雖小，但生理器官系統(tǒng)俱全，成分非常復(fù)雜，螨體至少含有十幾種變應(yīng)原組分，但最主要的致敏成分是1組和2組變應(yīng)原(Der1、Der2)，且每克灰塵含2μg的主要變應(yīng)原便可使過敏性體質(zhì)人群致敏，每克灰塵含10μg的主要變應(yīng)原便可使過敏性體質(zhì)人群發(fā)作過敏性疾病。其中De

3、r1的分子量為25Kd，屬半胱氨酸蛋白酶，其酶原可使1組變應(yīng)原發(fā)生自我裂解。Der2的分子量為14kD，類似附睪蛋白，其具體的生物功能還不完全清楚，但有報道稱2組變應(yīng)原含量與1組變應(yīng)原一樣高。由于2組螨變應(yīng)原比1組更耐熱及耐降解，與其它種屬間有更多的交叉反應(yīng)性，所以對于監(jiān)測環(huán)境中塵螨的含量從而回避變應(yīng)原預(yù)防塵螨過敏性疾病的發(fā)生更有實用價值。 本研究小組既往調(diào)查發(fā)現(xiàn)空調(diào)過濾網(wǎng)也是塵螨嗜好的棲居場所之一，且塵螨變應(yīng)原可隨空調(diào)送風(fēng)排入

4、室內(nèi)。調(diào)查結(jié)果顯示廣州、深圳地區(qū)粉塵螨較屋塵螨多，兩者占空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中螨的比例達80％左右。由于現(xiàn)代建筑的通風(fēng)性能較差，且隨著社會生活水平的提高，人們在密封空調(diào)環(huán)境內(nèi)工作、生活和學(xué)習(xí)時間越來越長，尤其是塵螨過敏體質(zhì)人群有可能因吸入此環(huán)境中的空氣而引發(fā)過敏性疾病。目前我國臨床上對過敏性疾病的主要處理措施是對已有疑似癥狀到醫(yī)院求醫(yī)的病人進行確診與治療，而在預(yù)防上迄今未有好的檢測手段及檢測方法。盡管國外已有以酶聯(lián)免疫方法開發(fā)的商品化的試劑盒供

5、應(yīng)，但存在價格昂貴(約五百英磅一盒)，在國內(nèi)沒有代理點等等問題而未能在我國廣泛應(yīng)用。而在國內(nèi)尚未見對于定量檢測塵螨變應(yīng)原含量方法學(xué)研究的報道。 研究目的: 1.基于關(guān)于定量檢測塵螨變應(yīng)原含量方面的研究狀況，在本課題組既往研究基礎(chǔ)上，針對廣州深圳地區(qū)空調(diào)灰塵優(yōu)勢螨種粉塵螨，建立檢測環(huán)境中粉塵螨2組變應(yīng)原Derf2含量的雙抗體夾心ELISA法。 2.將方法應(yīng)用于空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中粉塵螨2組變應(yīng)原Derf2含量的檢測，進一

6、步探討空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中塵螨變應(yīng)原與過敏性疾病發(fā)生的關(guān)系，對過敏人群制定防螨措施做好變應(yīng)原回避提供重要的參考依據(jù)。 研究內(nèi)容與方法:以終濃度為0.5mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG)對本實驗室保存重組子BL21star/pET24a/Derf2進行誘導(dǎo)表達，得到的蛋白經(jīng)Ni-NAT純化后梯度透析復(fù)性。采用塵螨過敏病人血清進行蛋白印跡(Western-Bl

7、otting)檢測。用純的rDerf2免疫新西蘭兔得到抗Derf2多克隆血清，經(jīng)檢驗合格后用飽和硫酸銨(NH4)2SO4進行鹽析沉淀，脫鹽后，以70mmol/LPH6.3的PB對DEAE-SepharoseF.F陰離子交換層析柱(AmershamPharmacia,Sweden)進行純化，再用過碘酸鈉氧化法進行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記，此酶標(biāo)抗體為雙抗體夾心法的檢測抗體。用DMEM培養(yǎng)粉塵螨Ⅱ組變應(yīng)原Derf2單克隆抗體，用Prot

8、einA親和層析柱純化，作為捕獲抗體而建立方法，用棋盤滴定法測定包被液的最佳濃度及酶結(jié)合物的最佳稀釋度。用建立起的雙抗體夾心法測定全國五大城市(廣州、深圳、南昌、上海及北京)2004年8月份(塵螨生長高峰期)的317臺家庭空調(diào)(廣州60臺，深圳84臺，南昌72臺，上海55臺，北京48臺)濾網(wǎng)灰塵中粉塵螨2組變應(yīng)原Derf2的含量。 研究結(jié)果: 1.含有rDerf2的陽性克隆菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8h后獲高效表達。Ni-NAT

9、親和層析純化后，純度達90％。Western-Blotting結(jié)果表明rDerf2具有良好的IgE結(jié)合活性。 2.免疫成功的兔血清經(jīng)硫酸銨沉淀+DEAESepharoseF.F離子交換層析后，抗Derf2多克隆抗體純度達90％以上。Derf2單克隆抗體的純度達95％以上。 3.棋盤滴定法顯示包被用的Derf2單克隆抗體最佳工作濃度為1ug/ml，HRP標(biāo)記的抗Derf2多克隆抗體的最佳稀釋度為1：1000。建立的雙抗體夾

10、心法檢測極限為2/4ng/ml，與參考標(biāo)準(zhǔn)方法相比，特異性為0.938，敏感性為0.918，準(zhǔn)確性為0.925，χ2檢驗得P＞0.05，新建立的雙抗體夾心方法與參考標(biāo)準(zhǔn)方法檢出率無差別。 4.檢測2004年8月份全國五大城市的317臺家庭空調(diào)(廣州60臺，深圳84臺，南昌72臺，上海55臺，北京48臺)濾網(wǎng)灰塵中Derf2含量的結(jié)果分別為廣州11.36±3.62μg/g灰塵,深圳8.89±1.76μg/g灰塵,南昌17.16±1

11、0.12μg/g灰塵，上海3.87±0.85μg/g灰塵，北京0.46±0.04μg/g灰塵。廣州、深圳、南昌和上海四個城市的含量均大于引起塵螨過敏性疾病致敏的閾值2μg/g灰塵，且廣州和南昌兩城市還大于引發(fā)塵螨過敏性疾癥狀的閾值10μg/g灰塵。只有北京一個城市低于2μg/g灰塵。 結(jié)論: 1.塵螨主要變應(yīng)原Derf2獲高效表達與純化，并具有良好的IgE結(jié)合活性。 2.用已純化的Derf2免疫動物，制備出粉塵螨