1、CD82/KAI1是四跨膜蛋白家族（tetraspanin superfamily）的重要成員之一。其主要生物學(xué)功能是參與細(xì)胞運(yùn)動、遷移的調(diào)節(jié)。CD82廣泛表達(dá)于各種正常的組織細(xì)胞，在腫瘤組織表達(dá)降低或不表達(dá)。最初研究發(fā)現(xiàn)CD82是前列腺癌特異的轉(zhuǎn)移抑制因子。后來大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在各種不同組織來源的腫瘤，CD82均可抑制其細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。CD82可抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動遷移能力，抑制動物模型瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，臨床上多種腫瘤的惡性程度及

2、轉(zhuǎn)移能力（尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力）與CD82蛋白的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，檢測CD82蛋白的表達(dá)可做為判斷腫瘤是否轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要指標(biāo)。因此，CD82被認(rèn)為是廣譜的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子(wide-spectruminvasion-and metastasis-suppressor)。
　　自從1995年CD82的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制能力被首次報(bào)道以來，對其作用機(jī)制進(jìn)行了不斷的探索，其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制正逐步被揭示。CD82抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移主要通過兩條途

3、經(jīng)來實(shí)現(xiàn)。一是直接與一些細(xì)胞表面黏附分子如整合素（integrin）、膜結(jié)合型免疫球蛋白(mIgG)等相互作用，影響細(xì)胞的浸潤及運(yùn)動遷移能力。二是直接或間接作用于一些細(xì)胞質(zhì)膜受體如生長因子受體等，影響其介導(dǎo)的信號跨膜傳遞，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)與運(yùn)動遷移相關(guān)的信號通路。
　　神經(jīng)節(jié)苷脂是分布于各種組織細(xì)胞表面的含有唾液酸的鞘糖脂。神經(jīng)節(jié)苷脂主要通過將疏水的神經(jīng)酰胺部分插入脂質(zhì)雙分子層的質(zhì)膜外層而定位于細(xì)胞膜上，其寡糖部分則暴露于細(xì)胞表面。

4、神經(jīng)節(jié)苷脂雖屬于細(xì)胞質(zhì)膜的微量組份，但它能夠與細(xì)胞膜上的其它組分如黏附分子、受體等相互作用，參與細(xì)胞識別黏附，調(diào)節(jié)受體介導(dǎo)的信號跨膜傳遞從而調(diào)節(jié)細(xì)胞分化及運(yùn)動遷移能力等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，CD82的轉(zhuǎn)移抑制作用與神經(jīng)節(jié)苷脂，尤其是GM2和GM3的關(guān)系十分密切。大量的研究表明，CD82與神經(jīng)節(jié)苷脂對多種組織來源的腫瘤轉(zhuǎn)移有協(xié)同抑制作用。如GM3與CD9對腫瘤轉(zhuǎn)移可發(fā)揮協(xié)同抑制作用。GM2與CD82對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制能力遠(yuǎn)大于二者的單獨(dú)作用。

5、GM2和GM3共同與CD82可發(fā)揮最大的協(xié)同抑制效應(yīng)。目前，對CD82與神經(jīng)節(jié)苷脂協(xié)同作用機(jī)理知之甚少。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞表面，CD82常與神經(jīng)節(jié)苷脂或其它四跨膜家族蛋白簇集分布在特定功能的膜微區(qū)，并募集一些膜分子如生長因子受體、整合蛋白、肌醇3激酶、PKC等形成特定功能的膜蛋白復(fù)合體（Tetraspanin Web）。CD82抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用有賴于Tetraspanin Web的形成。抑制Tetraspanin Web的形成，CD82

6、失去轉(zhuǎn)移抑制的作用。因此，弄清楚CD82與神經(jīng)節(jié)苷脂協(xié)同作用機(jī)理，以及Tetraspanin Web形成機(jī)制，對最終徹底闡明CD82抑制腫瘤轉(zhuǎn)移分子機(jī)理是十分重要的。弄清這一問題，首先要了解CD82與神經(jīng)節(jié)苷脂以及其他組成Tetraspanin Web分子之間相互識別、相互作用的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　CD82是跨膜糖蛋白，其胞外區(qū)有三個可N-糖基化的位點(diǎn)(Asn129，Asn157和Asn198)。將這些糖基化位點(diǎn)定點(diǎn)突變后，CD8

7、2抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用減弱或消失。提示N-糖鏈對CD82發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用是必需的。已知糖鏈的重要作用之一是參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-鞘糖脂之間的識別、粘連。因此，N-糖鏈可能做為CD82與神經(jīng)節(jié)苷脂及其他分子相互作用的重要結(jié)構(gòu)。
　　在本課題研究工作中，為探討神經(jīng)節(jié)苷脂與CD82協(xié)同抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理，我們進(jìn)行了以下幾個內(nèi)容的研究。
　　一.神經(jīng)節(jié)苷脂GM2/GM3對腫瘤細(xì)胞體外運(yùn)動遷移能力的影響及可能作用機(jī)理的研究。

8、采用不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力的小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株做為模型（淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株HCa-F和低轉(zhuǎn)移株HCa-P），比較了兩細(xì)胞株神經(jīng)節(jié)苷脂的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)兩細(xì)胞株神經(jīng)節(jié)苷脂組份有顯著的差異:低轉(zhuǎn)移的Hca-F細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂以較簡單的GM3為主（約占80％）。而高轉(zhuǎn)移的Hca-P細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂以GM2為主（約占70％），并含有較多的結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、GD1等。提示神經(jīng)節(jié)苷脂的差異性表達(dá)可能牽涉到兩細(xì)胞株淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移的能力。為此，我們

9、對GM3影響兩細(xì)胞株淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制做了進(jìn)一步的研究。我們用特異的神經(jīng)節(jié)苷脂合成抑制劑(PPPP)處理低轉(zhuǎn)移的Hca-P細(xì)胞，下調(diào)Hca-P細(xì)胞GM3的表達(dá);同時用外源性GM3處理高轉(zhuǎn)移的Hca—F細(xì)胞，以上調(diào)Hca—F細(xì)胞GM3的表達(dá)，然后采用Boyden小室培養(yǎng)和Western bloting技術(shù)，分別觀察了GM3對兩細(xì)胞株表皮生長因子受體(EGFR)的磷酸化活化、細(xì)胞內(nèi)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，以及兩

10、細(xì)胞株細(xì)胞的體外遷移能力的影響。
　　結(jié)果:(1)神經(jīng)節(jié)苷脂合成抑制劑(PPPP)下調(diào)低轉(zhuǎn)移的Hca-P細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂的合成（下調(diào)GM3的表達(dá)），可促進(jìn)細(xì)胞體外運(yùn)動遷移;但同樣下調(diào)高轉(zhuǎn)移的Hca-F細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂的合成（下調(diào)GM2的表達(dá)），則不影響其體外運(yùn)動遷移。說明是GM3而不是GM2可影響細(xì)胞體外運(yùn)動遷移，GM3的作用是抑制細(xì)胞的運(yùn)動遷移。(2)下調(diào)低轉(zhuǎn)移的Hca-P細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂的合成（下調(diào)GM3的表達(dá)），可促進(jìn)EGFR的1

11、173酪氨酸殘基磷酸化及PKB/Akt的絲氨酸473、蘇氨酸308殘基磷酸化;增加外源性GM3，上調(diào)高轉(zhuǎn)移的Hca—F細(xì)胞GM3含量，可抑制EGFR的1173酪氨酸殘基磷酸化及PKB/Akt的絲氨酸473、蘇氨酸308殘基磷酸化，說明GM3可抑制EGFR的活化，下調(diào)PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這可能是GM3抑制細(xì)胞的運(yùn)動遷移的機(jī)制之一。(3)采用PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑阻斷PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可抑制細(xì)胞的遷移運(yùn)動能力。說明PI3K信號轉(zhuǎn)

12、導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移運(yùn)動能力的細(xì)胞內(nèi)主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　結(jié)論:(1) GM3是影響兩細(xì)胞株細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力的重要因素之一，其作用是抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。(2) GM3抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能分子機(jī)制之一是抑制EGFR自身磷酸化活化，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性。
　　二.神經(jīng)節(jié)苷脂與CD82協(xié)同抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理的研究。
　　我們采用人淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株為模型，對神經(jīng)節(jié)苷脂與CD82協(xié)

13、同抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理進(jìn)行了研究。SW620細(xì)胞株幾乎無CD82表達(dá)，GM2是其主要神經(jīng)節(jié)苷脂組分。我們采用神經(jīng)節(jié)苷脂合成抑制劑(PPPP)或添加外源性神經(jīng)節(jié)苷脂以改變神經(jīng)節(jié)苷脂含量，或采用分子生物學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)染CD82基因使其過表達(dá)，然后采用Boyden小室培養(yǎng)和Western bloting技術(shù)，分別觀察了GM3和CD82不同處理?xiàng)l件下SW620細(xì)胞體外遷移能力、表皮生長因子受體(EGFR)的磷酸化活化、細(xì)胞內(nèi)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

14、PI3K/AKT、MAPK和PLCγ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性影響。
　　結(jié)果:(1) GM3抑制EGFR刺激的SW620細(xì)胞體外遷移運(yùn)動，同時抑制EGFR的酪氨酸1173殘基和PKB/Akt的絲氨酸473殘基磷酸化;GM2對細(xì)胞遷移、EGFR和PKB/Akt磷酸化均無影響。(2) CD82過表達(dá)抑制EGFR刺激的SW620細(xì)胞體外的遷移運(yùn)動，同時抑制EGFR的酪氨酸1045殘基和ERK的磷酸化。(3) GM3和GM2均可增強(qiáng)CD82對SW

15、620細(xì)胞體外遷移運(yùn)動的抑制作用，但GM3增強(qiáng)CD82對EGFR酪氨酸殘基1173和Akt磷酸化的抑制作用，GM2增強(qiáng)CD82對EGFR酪氨酸殘基1045和Erk磷酸化的抑制作用。(4) GM3和GM2共同與CD82作用可對細(xì)胞遷移產(chǎn)生最大的協(xié)同抑制效應(yīng)，同時抑制EGFR的1173酪氨酸殘基、1045位酪氨酸殘基磷酸化，和Akt、Erk的磷酸化。說明GM3和GM2與CD82產(chǎn)生最大協(xié)同抑制效應(yīng)可能是同時抑制EGFR的1173酪氨酸殘基、

16、1045位酪氨酸殘基磷酸化，同時下調(diào)細(xì)胞內(nèi)和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的結(jié)果。
　　結(jié)論:(1) GM3單獨(dú)可抑制EGFR刺激的SW620細(xì)胞體外遷移運(yùn)動，其原理是抑制EGFR的酪氨酸1173殘基磷酸化及活化，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PI3K/AktK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而GM2則無作用。(2) CD82單獨(dú)也可抑制EGFR刺激的SW620細(xì)胞體外遷移運(yùn)動，但其原理是抑制EGFR的酪氨酸1045殘基磷酸化及活化，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。(3)

17、GM3和GM2單獨(dú)均可與CD82產(chǎn)生協(xié)同抑制作用，但機(jī)理不同。GM3與CD82協(xié)同抑制機(jī)理是增強(qiáng)對EGFR酪氨酸殘基1173殘基磷酸化的抑制和下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PI3K/AktK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。GM2與CD82協(xié)同抑制機(jī)理是增強(qiáng)對EGFR酪氨酸殘基1045殘基磷酸化的抑制和下調(diào)細(xì)胞內(nèi)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。說明GM3和GM2分別通過不同的機(jī)制與CD82發(fā)揮協(xié)同作用。(4) GM3和GM2共同與CD82作用可對細(xì)胞遷移產(chǎn)生最大協(xié)同抑制效應(yīng)，其原理是同

18、時抑制EGFR的1173酪氨酸殘基、1045位酪氨酸殘基磷酸化，同時下調(diào)細(xì)胞內(nèi)和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性。
　　三.CD82 N-糖鏈在神經(jīng)節(jié)苷脂與CD82協(xié)同抑制轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)理的研究。
　　已知細(xì)胞表面糖脂及糖蛋白的聚糖糖鏈的重要作用之一是參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-鞘糖脂之間的識別、粘連。為弄清CD82胞外結(jié)構(gòu)N-糖鏈在CD82與神經(jīng)節(jié)苷脂協(xié)同抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，我們采用基因重組技術(shù)構(gòu)建了攜帶CD82cDNA的

19、重組質(zhì)粒pcDNA4.0-CD82-V5。以此為模型，采用點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了不同N-糖基化位點(diǎn)突變的CD82重組質(zhì)粒，將其用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞，觀察不同N-糖基化位點(diǎn)突變的CD82表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞亞器的分布，及對細(xì)胞體外運(yùn)動遷移能力的影響。并篩選了穩(wěn)定表達(dá)不同突變體的細(xì)胞株，對部分突變體在細(xì)胞表面脂筏中的分布進(jìn)行了初步的研究。
　　結(jié)果:(1)構(gòu)建了攜帶CD82 cDNA的重組質(zhì)粒pcDNA4/V5-CD82以及不同N-

20、糖基化位點(diǎn)突變的CD82重組質(zhì)粒，包括Asn129、Asn157、Asn198單位點(diǎn)突，Asn129/Asn157、Asn129/Asn198、Asn157/Asn198雙點(diǎn)突變和Asn129/Asn157/Asn198三點(diǎn)突變的CD82突變體，基因測序證明構(gòu)建成功。(2)細(xì)胞組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同N-糖基化位點(diǎn)突變的CD82突變體在SW620成功表達(dá)。除雙點(diǎn)突變Asn157/Asn198和三點(diǎn)突變的Asn129/Asn157/Asn1

21、98的CD82分布在胞內(nèi)，其余突變體均在細(xì)胞表面表達(dá)。(3) Asn129/Asn157、Asn157/Asn198、Asn129/Asn157/Asn198位點(diǎn)突變可影響CD82對腫瘤細(xì)胞體外遷移的抑制作用。(4)篩選了穩(wěn)定表達(dá)Asn129/Asn157/Asn198突變體的細(xì)胞株，采用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞膜脂筏，觀察不同N-糖基化位點(diǎn)突變對CD82在脂筏分布的影響。
　　結(jié)論:(1)成功構(gòu)建了不同N-糖基化位點(diǎn)突變的CD82重