1、在眾多影響動物繁殖的環(huán)境因素中，內(nèi)毒素（Endotoxin）感染和熱應激（Heat stress）是兩個非常重要的方面。內(nèi)毒素化學本質(zhì)是脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）。LPS和熱應激都能夠通過多種路徑對動物機體造成不良影響，本研究著重探討二者對動物繁殖產(chǎn)生的不良影響。已有研究結(jié)果證明，LPS或熱應激作用于活體動物時，均能顯著抑制生殖內(nèi)分泌軸，抑制激素分泌、發(fā)情、排卵，降低受胎率和活胎率等。卵泡顆粒細胞（Granu

2、losa Cell）是一種高度分化的體細胞，與卵母細胞關系密切，在動物繁殖活動中發(fā)揮重要作用，而關于LPS和熱應激對顆粒細胞的直接影響及作用機理仍缺乏深入了解。因此，本研究以離體培養(yǎng)的豬顆粒細胞為模型，旨在探討LPS和熱應激對顆粒細胞形態(tài)、增殖、凋亡和激素分泌功能的影響，并對作用路徑進行初步研究。
　　經(jīng)過前期預實驗確定LPS實驗處理時間為48h，熱應激處理實驗為3h。利用掃描電子顯微鏡分別放大1000×、5000×、10000×

3、和15000×觀察LPS或熱應激對細胞形態(tài)產(chǎn)生的影響。在LPS對顆粒細胞增殖、凋亡和雌激素分泌影響的研究中，利用CCK8測定細胞增殖情況；利用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒借助流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；利用ELISA法測定培養(yǎng)液中E2含量，利用Western Blot檢測細胞MAPKs蛋白含量，包括ERK、Phospho ERK、JNK、Phospho JNK、p38、Phospho p38 MAPK；利用qRT

4、-PCR檢測與細胞增殖周期相關的基因FN1、IGF2、IGFBP2、Cyclin D1、Cyclin D2和P27kip的表達。針對LPS和熱應激對顆粒細胞功能的影響檢測了基因P450arom、FSHR的表達。同時檢測了HSP70基因的表達，研究發(fā)現(xiàn)，LPS和熱應激都能夠激活顆粒細胞HSP70基因，使這兩個環(huán)境不良因素對動物繁殖影響產(chǎn)生交匯點，因此利用小分子物質(zhì)HSP70抑制劑（VER155008）和HSP70激活劑（STA-4783）

5、針對HSP70作相應處理，隨后分別檢測三個基因的表達和HSP70蛋白的表達。并在HSP70過表達的基礎上利用Western Blot和細胞免疫熒光染色實驗對Phospho Smad3進行了定量和定位。
　　結(jié)果顯示LPS處理后，細胞飽滿，有較多微絨毛發(fā)和偽足，細胞狀態(tài)和活力均優(yōu)于對照組。1000ng·mL-1濃度LPS即可顯著促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、提高活細胞百分率（P<0.05），而500ng·mL-1 LPS即可促進與細胞

6、生長增殖、周期相關基因FN1（P<0.01），IGF2、IGFBP2（P<0.05），Cyclin D1、Cyclin D2（P<0.01）的表達，抑制阻礙細胞周期的基因P27kip（P<0.01）的表達。細胞MAPKs蛋白含量中，各總蛋白含量不變，各磷酸化蛋白含量增加。熱應激處理使細胞固縮，微絨毛及偽足消失，細胞狀態(tài)比對照組差。LPS和熱應激均可強烈抑制芳香化酶P450arom和FSHR基因的表達（P<0.01），LPS刺激還能夠顯著

7、抑制E2的分泌（P<0.01）。LPS和熱應激均可在轉(zhuǎn)錄和反應水平上顯著地上調(diào)HSP70基因的相對表達量（P<0.01）。經(jīng)HSP70抑制劑（VER155008）處理后，HSP70基因相對表達量代償性上調(diào)，蛋白表達量被抑制。P450arom和FSHR基因的相對表達量顯著回調(diào)（P<0.01）。在應用HSP70激活劑（STA-4783）后，HSP70基因被極顯著激活（P<0.01），基因相對表達量增加超過50倍，蛋白表達量顯著上調(diào)。P450