1、本研究主要對小細胞性B-NHL(SBCLs)和彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)這兩種B-NHL的VH基因結構進行比較，鑒別其VH基因的結構特點與淋巴瘤的發(fā)病、發(fā)展是否存在聯(lián)系。 研究材料：收集1997-2005年我醫(yī)學院附屬醫(yī)院及省內其它醫(yī)院的B-NHL標本110例，其中SBCLs71例，DLBCL39例。全部標本經10％中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、4～5μm連續(xù)切片、HE染色。 研究方法 (1)免疫組化。

2、 采用CD20(L26)、CD45RA(4KB5)免疫組化S-P法標記39例DLBCL和71例SBCLs，明確診斷。CD23(M0763)、CD5(M7194)、CyclinD1(M7155)、IgD(M0703)、BCL-6(PG-B6P)、FDC(CNA42)標記SBCLs亞群。 (2)PCR擴增和克隆。 通過半巢式PCR擴增VH基因，上游引物為：tgga/gtccgc/acagg/cct/ct/ccngg(

3、FR2A)；下游引物為：tgaggagacggtgacc(LJH)和gtgaccagggt(a/g/c/t)ccttggccccag(VLJH)。PCR過程中設立陽性對照和陰性對照：陽性對照是Raji細胞株，陰性對照為不加任何DNA模板的反應體系。所有病例的PCR產物均采用雙向測序。 將瓊脂糖凝膠電泳中的目的條帶割膠純化后進行TA克隆。每個樣本至少隨機挑選5個克隆進行測序分析。 (3)序列的分析方法。 運用NCB

4、I的序列分析軟件將我們的測序結果與胚系序列比對，分析其同源性。VH、DH、JH片段主要通過V-Base數據庫和NCBI中的IgBlast軟件進行界定。 (4)克隆內多樣性的分析方法。 為了評價淋巴瘤是否存在持續(xù)超突變，每個樣本至少挑選5個克隆進行測序?？寺榷鄻有缘脑u價遵循以下標準：非恒定的突變，指的是僅僅在樣本的單一克隆中出現的點突變；恒定突變，指的是在同一樣本的兩個以上克隆內均出現的點突變。只有恒定突變被認為是克隆內

5、多樣性的標記；非恒定突變則被認為是Taq聚合酶誤配所引起。克隆內多樣性的頻率計算為：克隆內突變的核苷酸數目/(序列總的核苷酸數×選取的克隆數)。 (5)抗原選擇的分析方法。 評價某一病例的SHM形式是否符合抗原選擇特征有2種方法。一、分析互補決定區(qū)2(CDR2)和框架區(qū)3(FR3)區(qū)域的替代突變/沉默突變(R/S)比率。當CDR2中R/S大于2.9且FR3中的R/S小于1.5時，則認為這一序列的SHM符合抗原選擇。二、僅

6、僅考慮FR3中的R/S，即當FR3中R/S小于1.6便認為該序列符合抗原選擇特征。 研究結果： 根據腫瘤的免疫表型和形態(tài)學特征，對71例SBCLs進行鑒別診斷，得到MALT37例，DLBCL伴MALT區(qū)域9例，FL7例，MCL9例，NMZL2例，SMZL3例，剩余4例未明確診斷。將明確診斷的MALT(共37例)、DLBCL伴MALT(9例)以及39例DLBCL病例全部行PCR擴增其VH片段，結果10例MALT和10例DL

7、BCL成功擴增了IgVH基因的CDR2和FR3區(qū)域，并直接測序。將含有殘留MALT成分的DLBCL病例分別擴增其兩種細胞群的VH基因，并對成功擴增的病例進行克隆測序。1例DLBCL伴MALT的DLBCL細胞群和1例DLBCL伴MALT的MALT成分成功進行了克隆測序(討論SHM頻率時分別納入DLBCL和MALT的范疇)。此外對單純的4例MALT和5例DLBCL也進行克隆測序，分析其克隆內超突變情況。 (1)本研究的MALT病例中

8、有7例使用了VH3基因家族，3例使用VH4基因家族。VH3基因家族的使用率高達64％，比正常外周血中VH3的使用率(50％)高。DLBCL中7例VH3，4例VH4-34。在這個僅僅10個病例構成的小樣本中VH4-34基因的使用率達到36％，遠遠高于正常周圍血液。但是尚需要擴大樣本研究才能對DLBCL中是否存在VH4-34基因家族的偏向性下結論。依據Corbett等人提出的規(guī)則：至少有10個連續(xù)的核苷酸與公認的胚系D基因片段相吻合。我們的

9、病例中可以識別出D片段的MALT和DLBCL病例各為5例。根據另外一條相對不那么嚴格的規(guī)則：至少有6個連續(xù)片段與胚系片段相吻合，或者7個片段吻合(中間可有一個不吻合)，則另外3例MALT和2例DLBCL也可以辨別出D片段。當病例的D片段與多個胚系D片段有高度同源性時，優(yōu)先考慮與其后的JH片段有重疊的胚系D片段。我們病例的JH片段以JH5最常見，其中MALT中有5例，DLBCL中有4例，其次為JH4，JH6。 (2)以突變頻率超過

10、2％作為鑒定發(fā)生SHM的界線，所有的MALT和10例DLBCL病例均發(fā)生了SHM。剩余1例DLBCL與胚系序列的同源性＞98％，未發(fā)生SHM。在11例MALT中VH基因的突變頻率介于2.38％-20.79％，平均為9.58％。DLBCL突變頻率介于1.18％-13％，平均值為7.5％。對兩組淋巴瘤的VH基因SHM頻率的通過T檢驗發(fā)現不存在顯著差異(P=0.227，t=1.246)。這些病例的SHM分析發(fā)現大部分的突變?yōu)辄c突變，但是也存在

11、連續(xù)2個或3個核苷酸的替換，特別是在同一密碼子內出現。此外在MALT病例7中還見到一處3個核苷酸的缺失片段。 (3)研究的22個病例均呈功能性VH重排，內部未見終止密碼子，有編碼免疫球蛋白的潛在功能。根據上面提到的兩條規(guī)則，9例MALT和6例DLBCL呈現抗原選擇。 (4)有1例DLBCL伴MALT病例的MALT細胞群克隆測序成功，分析顯示它存在克隆內多樣性，克隆內超突變的頻率為0.35％。另1病例的DLBCL細胞群擴增

12、成功，對其挑選了8個克隆進行測序，未發(fā)現克隆內SHM。此外還對4例MALT病例以及5例胃腸道DLBCL進行克隆測序。其中2例MALT(其中1例位于扁桃體)以及2例胃腸道DLBCL未見克隆內多樣性，而另2例MALT和3例DLBCL存在克隆內多樣性。 研究結論： (1)本組實驗中的MALT來自GC后B細胞，其超突變的平均頻率為9.58％，比國外文獻報道的4-4.5％要高。 (2)DLBCL存在多源性，即可以來自GC前