1、弓形蟲病是世界性流行的人畜共患病之一，由細胞內(nèi)專性寄生性原蟲一剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)感染引起的全身性疾病。弓形蟲感染多種動物，貓科動物為終末宿主，人類免疫正常者雖多為隱性感染，但弓形蟲眼病、肝病的臨床報道屢見不鮮，甚至可以引起弓形蟲腦病，更是免疫功能低下和免疫功能缺陷者最為常見的感染來源和死亡原因之一。孕婦感染可以導致胎兒畸形、流產(chǎn)、死胎等不良孕產(chǎn)結(jié)果，是計劃生育、優(yōu)生優(yōu)育的大敵。估計世界人口的30％可能攜帶該寄

2、生蟲，美國人群血清學陽性率為22.5％，薩爾瓦多40歲年齡組血清學陽性率高達75％；我國人口血清學平均陽性率為5％-20％，且有不斷上升的趨勢。雖然爆發(fā)流行多與食品和水污染有關，但不能解釋逐年升高的現(xiàn)象；國內(nèi)外調(diào)查結(jié)果普遍認為飼養(yǎng)動物與弓形蟲感染有關，但危險程度如何，相對危險度為多少，未見報道。為摸清人類感染的主要來源，更好地控制和預防弓形蟲病的傳播，該課題進行了人群血清流行病學調(diào)查。在濟寧、棗莊、臨沂隨機選擇1-2個居民區(qū)，入戶調(diào)查，

3、每人一表，養(yǎng)狗和養(yǎng)貓者及(1：1)對照各采血0.5-1ml，對照選擇性別、年齡、住址和職業(yè)相同者，統(tǒng)一編號后帶回實驗室分離血清。酶聯(lián)免疫吸附法檢測弓形蟲抗體，試劑為衛(wèi)生部全國人體重要寄生蟲病現(xiàn)況調(diào)查辦公室統(tǒng)一提供、珠海經(jīng)濟特區(qū)海泰生物制藥有限公司生產(chǎn)的弓形蟲IgG抗體酶免檢測試劑盒。調(diào)查人員統(tǒng)一培訓，統(tǒng)一方法，實驗采用雙盲法。共調(diào)查500人，檢出陽性者79人，總體陽性率為17.54％。其中58例同時養(yǎng)狗和貓者16人陽性，陽性率為27.5

4、9％，未作對照；單純養(yǎng)狗或貓者及其對照442人，63人抗體陽性，陽性率為14.25％。不養(yǎng)寵物者221人，19人陽性，陽性率為8.60％；養(yǎng)寵物者221人，陽性44人，陽性率為19.91％，兩組差異非常顯著，x2=11.57，P＜0.001。單純養(yǎng)狗者127人，21人陽性，陽性率為16.54％；單純養(yǎng)貓者94人，23人陽性，陽性率為24.47％。單純養(yǎng)狗者、單純養(yǎng)貓者、同時養(yǎng)狗和貓者的比值比(OR)分別為2.106、3.444、4.05

5、，即感染機會為對照組的2-4倍。歸因危險性分別為52.38％、70.96％、75.31％，也就是說單純養(yǎng)狗者中52％的感染由于養(yǎng)狗所致，單純養(yǎng)貓者約71％的感染因養(yǎng)貓所致，同時養(yǎng)狗和貓者約75％的感染由此而得。寵物熱似乎是城市人口弓形蟲感染升高的主要原因，但不能解釋農(nóng)村人口弓形蟲感染率的上升。飯前便后每次洗手和經(jīng)常洗手者感染率為13.19％，偶爾和從不洗手者感染率為34.04％，兩組差異顯著(x2=14.53，P＜0.01)。顯示個人衛(wèi)

6、生狀況與弓形蟲感染密切相關，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人均教育水平的提高，個人衛(wèi)生狀況有了顯著改善，顯然不是弓形蟲感染率上升的原因。吃生雞蛋組感染率(21.05％)明顯高于不吃生雞蛋組(13.61％)，具有統(tǒng)計學顯著性意義(x2=4.59，P＜0.05)。有喝生乳習慣者6人，陽性3人，無此習慣者436人中60人陽性(x2校=3.74，P≈0.05)。ChiariCdeA等(1984)與SkinnerLJ等(1990)先后報道了喝未消毒山羊奶感

7、染弓形蟲病的實例，并在羊乳中分離到弓形蟲。PowellCC.等再次報道，6只實驗感染貓有5只乳液中檢測到弓形蟲(PCR與小鼠接種法)。雖然吃生雞蛋、喝生乳為弓形蟲感染途徑之一，但人群中有此習慣者僅為少數(shù)，仍然不能解釋十年間弓形蟲感染率如此大幅的上升。國外學者報道豬、羊肉是一種潛在的傳染來源；隨著生活水平的提高，商品肉的人均消耗量增加，由于食品加工過程生熟不分(50％-95％的家庭不能作到生熟案板分開)造成交叉污染和追求味道鮮美的過程中食

8、入半生不熟的肉制品，誤食包囊和速殖子感染的機會大大增加。該課題應用巢式PCR技術對商業(yè)肉制品弓形蟲污染率進行了調(diào)查。以速殖子表面抗原(SAG2)基因為目的基因，設計5'端外源性引物、內(nèi)源性引物，擴增終產(chǎn)物為241-bp核苷酸片段；3'端外源性引物、內(nèi)源性引物，擴增終產(chǎn)物為221-bp核苷酸片段.25μ1反應體系，外源性上下引物、模板、dNTP各1μl，buffer2.5ul，水18μl，Taq酶0.5μl，94℃預變性2分鐘，94℃變性

9、40秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，32個循環(huán)，72℃延伸7分鐘。再以擴增產(chǎn)物為模板，相同條件下用內(nèi)源性引物擴增。擴增產(chǎn)物進行3％瓊脂糖電泳證實達到設計要求。用宿主DNA提取液(0.06-0.3μg/μl)加入1μl弓形蟲陽性模板，倍比稀釋后檢測發(fā)現(xiàn)，稀釋50-100倍檢測效果最好，檢出最低濃度為10-5μg/μl。在每克標本中加入1-5個原蟲時檢出結(jié)果良好，敏感性達到預期目標，具備國際同類方法先進水平。共檢測動物標本89份，陽

10、性22份，陽性率為24.72％。其中豬肉標本56份，16份陽性，陽性率為28.57％；羊肉標本33份，6份陽性，陽性率為18.18％?？梢刹∪搜獦吮?份，陽性。結(jié)果證明，肉類污染率較高，山東省動物感染較為普遍，但與十年前相比不如人群感染變化明顯，是否與人群間流行型有所不同?弓形蟲為頂復門球蟲亞綱原蟲，染色體為單倍體(在貓科動物體內(nèi)有性生殖除外)，包含8x107個堿基對，依據(jù)主要表面抗原SAG2基因不同分為三型，PCR純化產(chǎn)物分別以Sau

11、3AI(5'端)和HhaI(3'端)酶切(37℃4小時)，酶切產(chǎn)物進行3％瓊脂糖凝膠電泳。Ⅰ型，兩端均不可切；Ⅱ型，3'端可切；Ⅲ型，5'端可切。各型毒力和流行病學不同，Ⅰ型、Ⅱ型為人類感染的主要類型，Ⅰ型毒力強，多見于先天性感染，Ⅲ型次之，多為動物感染，Ⅱ型為弱毒株，多見于免疫抑制或免疫功能低下患者。血清學可以檢測到型特異性抗體,。但也有不同報道，有人認為動物感染以Ⅱ型為主，TanyaV.Aspinall等(2002)報道，27份肉制

12、品全部Ⅰ型陽性，其中6份為Ⅰ型與Ⅱ型混合陽性。國內(nèi)尚未見有關弓形蟲SAG2分型研究的報告。弓形蟲SAG2分型研究，不僅有重要的流行病學意義，幫助更好地了解人畜間傳播的方式與途徑，對于臨床預后判斷、治療方案的制定以及藥物與疫苗的開發(fā)研究有著極為重要的意義。因而該課題在應用巢式PCR技術對商業(yè)肉制品弓形蟲污染率調(diào)查的基礎上進行了SAG2臨床分型(具體操作見材料與方法)。22份陽性標本中單純Ⅰ型18份(81.82％)，單純Ⅱ型1份，Ⅱ型與Ⅰ型

13、混合感染2份(9.09％)，Ⅲ型未能檢測到。其中，豬肉標本16份陽性，Ⅰ型13份，Ⅱ型以及Ⅰ型與Ⅱ型混合感染各1份，未能定型1份；羊肉標本33份，6份陽性，Ⅰ型5份，Ⅱ型與Ⅰ型混合感染1份?？梢刹∪搜獦吮?份為Ⅰ型陽性，與絕大多數(shù)報道人類感染型為Ⅰ型和Ⅱ型的結(jié)果是一致的。動物感染單純Ⅰ型占81.82％，加上混合感染，90.91％的動物感染了Ⅰ型，與人類感染型一致，證明豬、羊肉確為人類潛在的傳染來源。 綜上所述，該課題成功建立了弓

14、形蟲SAG2基因檢測與分型研究方法。山東省人與動物弓形蟲感染率均很高。主要商業(yè)肉制品(豬肉、羊肉)弓形蟲污染率很高，以Ⅰ型為主，是人類重要的潛在感染來源之一。隨著生活水平的提高，商品肉的人均消耗量增加，由于食品加工過程生熟不分(50％-95％的家庭不能作到生熟案板分開)造成交叉污染和追求味道鮮美的過程中食入半生不熟的肉制品，誤食包囊和速殖子感染成為山東省人群弓形蟲感染率大幅增高的主要因素。養(yǎng)狗/貓與弓形蟲感染密切相關。寵物熱是城市人口弓