1、大菱鲆(Scophthalmus maximus)是珍貴的海洋經(jīng)濟(jì)魚類，目前已經(jīng)在我國(guó)大規(guī)模養(yǎng)殖。隨著高密度工廠化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，諸多疾病相繼出現(xiàn)，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，其中，腹水病是危害最大的疾病之一，其病原是遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)。目前，對(duì)魚類細(xì)菌病的防治方法主要采取頻繁使用抗生素及化學(xué)藥品的方法，其所帶來的耐藥性、食品及環(huán)境安全問題愈加突出。因此，免疫成為防治魚類細(xì)菌性疾病的安全有效方法。本文采用組

2、織制片觀察、單克隆抗體免疫組化標(biāo)記、間接熒光法和流式細(xì)胞術(shù)等手段，首先，對(duì)不同年齡的養(yǎng)殖大菱鲆粘膜及淋巴細(xì)胞進(jìn)行研究，描述并比較了不同年齡大菱鲆的粘膜及免疫組織的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)；然后，以置備的遲緩愛德華氏菌滅活全菌和主要OPM為抗原，對(duì)大菱鲆進(jìn)行腹腔注射、直接浸泡和肛門灌注免疫接種，以Ig+細(xì)胞相對(duì)數(shù)量及血清特異抗體凝集效價(jià)為指標(biāo)，對(duì)大菱鲆粘膜免疫與系統(tǒng)免疫應(yīng)答進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較，闡述了大菱鲆粘膜組織具有相對(duì)獨(dú)立的特異性免疫應(yīng)答功能，以及不同抗

3、原的免疫效果。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： (1)大菱鲆粘膜及免疫組織的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)研究。組織切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)，大菱鲆皮膚、鰓、后腸、頭腎和脾中存在淋巴細(xì)胞。利用大菱鲆IgM單抗免疫組化標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，除皮膚外，鰓、后腸、頭腎和脾中均原位存在Ig+細(xì)胞，其中，鰓組織中Ig+細(xì)胞存在于鰓小片的上皮與支持細(xì)胞之間的間隙中，后腸Ig+細(xì)胞存在腸道的固有層和粘膜下層中，外周血Ig+細(xì)胞主要存在于淋巴細(xì)胞群中，脾Ig+細(xì)胞分布在實(shí)質(zhì)區(qū)，且更傾向于分布

4、在脾竇周圍，頭腎Ig+細(xì)胞無規(guī)律地散布于腎組織中。采用間接熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞儀對(duì)受精后2.5和10月齡大菱鲆的皮膚、鰓、后腸、外周血和頭腎中Ig+細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)、分析后發(fā)現(xiàn)，同一年齡大菱鲆的不同組織中Ig+細(xì)胞的數(shù)量不同，同時(shí)，不同年齡魚的同一組織的Ig+細(xì)胞數(shù)量也有差異。2.5月齡大菱鲆Ig+細(xì)胞分布為：皮膚0.00±0.00％、鰓1.58+0.40％、后腸2.53±0.70％、外周血17.0±0.39％和頭腎21.0±1.79％；10

5、月齡魚Ig+細(xì)胞分布為：皮膚0.94±0.74％，鰓1.60±0.71％、后腸3.91±1.06％、外周血28.95+0.39％和頭腎21.54+0.90％。 (2)遲緩愛德華氏菌的分離、鑒定及抗原的制備。從患腹水病大菱鲆體內(nèi)分離純化出主要病原菌株，用生化鑒定及16S rRNA基因序列測(cè)定和分析方法鑒定為遲緩愛德華氏菌；用0.5％福爾馬林滅活法，制備了安全的遲緩愛德華氏菌滅活全菌抗原；用Sarkosyl法，制備了安全的遲緩愛德華

6、氏菌主要OPM抗原。 (3)大菱鲆粘膜及淋巴細(xì)胞對(duì)遲緩愛德華氏菌滅活全菌抗原的免疫應(yīng)答。直接浸泡后，鰓組織中的Ig+細(xì)胞數(shù)量的出現(xiàn)峰值時(shí)間比外周血、頭腎組織提前7天，鰓中的Ig+細(xì)胞數(shù)量極顯著高于未免疫組，而外周血和頭腎的Ig+細(xì)胞數(shù)量與未免疫組大菱鲆差異不顯著：腹腔注射后，鰓組織Ig+細(xì)胞數(shù)量的出峰值時(shí)間與外周血、頭腎相同，鰓中Ig+細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組差異不顯著，且極顯著低于浸泡免疫組，外周血和頭腎的Ig+細(xì)胞數(shù)量則極顯著高于對(duì)

7、照組及浸泡免疫組。另外，浸泡免疫后，免疫魚體針對(duì)全菌抗原的血清抗體效價(jià)顯著高于對(duì)照組，且其達(dá)到峰值的時(shí)間與浸泡免疫后鰓組織中Ig+細(xì)胞的峰值時(shí)間相同，表明浸泡免疫后大菱鲆的血清特異抗體主要來源于鰓組織中Ig+細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。 (4)大菱鲆粘膜及淋巴細(xì)胞對(duì)不同抗原的免疫應(yīng)答。用遲緩愛德華氏菌滅活全菌及主要OPM分別對(duì)大菱鲆進(jìn)行腹腔注射、直接浸泡和肛門灌注免疫后發(fā)現(xiàn)，注射OPM的大菱鲆外周血中Ig+細(xì)胞數(shù)量和血清抗體效價(jià)均不顯

8、著低于注射遲緩愛德華氏菌滅活全菌大菱鲆；浸泡OPM大菱鲆鰓中Ig+細(xì)胞數(shù)量和血清抗體效價(jià)均不顯著高于浸泡滅活全菌的大菱鲆，肛門灌注OPM大菱鲆后腸、外周血中Ig+細(xì)胞相對(duì)數(shù)量和血清抗體效價(jià)均不顯著高于注射滅活全菌大菱鲆。 本文研究結(jié)果表明，粘膜組織具有特異性免疫應(yīng)答的組織細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)抗原可以產(chǎn)生顯著的相對(duì)獨(dú)立的特異性免疫應(yīng)答；大菱鲆體內(nèi)存在粘膜免疫和系統(tǒng)免疫，不同免疫途徑對(duì)不同免疫組織的誘導(dǎo)作用不同，浸泡免疫主要誘導(dǎo)體表粘膜組