1、偽狂犬?。≒seudorabies,PR）又稱 Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科（Alpha-herpesririnae）引起的多種動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、繁殖障礙、神經(jīng)癥狀（腦脊髓炎）為主要臨床癥狀的高度致死性、急性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其歸為二類動(dòng)物傳染病，是典型的極難防疫的自然異源性疾病，給全球畜牧業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。豬偽狂犬病毒（Pseudorabies

2、 virus，PRV）是豬偽狂犬病的病原，其基因組為雙股線性DNA，全長(zhǎng)為150kb左右，有70-100種編碼蛋白質(zhì)，成熟的病毒粒子約含有50種蛋白質(zhì)。
　　長(zhǎng)期以來(lái)，研究皰疹病毒基因功能的主要方法是通過(guò)構(gòu)建基因缺失突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但傳統(tǒng)的同源重組使構(gòu)建工作非常繁瑣，得到的突變株遺傳穩(wěn)定性差，使皰疹病毒的研究受到了限制。自從1999年，美國(guó)學(xué)者Gregoory等［1］成功構(gòu)建了偽狂犬病毒的全長(zhǎng)感染性克隆以來(lái)，對(duì)皰疹病毒基因結(jié)構(gòu)和功

3、能的研究起到了巨大的推動(dòng)作用，并為皰疹病毒作為高效載體系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)提供了嶄新的途徑。
　　本研究根據(jù)PRV Fa株的部分TK基因以及兩側(cè)的UL22、UL24基因擴(kuò)增含有兩個(gè)Loxp位點(diǎn)的左、右同源臂，將獲得的左、右同源臂Fa TKA和Fa TKB替換本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體pUC-TKA2-GFP-gpt-TKB（PRV流行毒株）中的TKA2和TKB，獲得PRV Fa株的中間轉(zhuǎn)移載體pUC-Fa TKAM-GFP-gpt-Fa

4、TKB,然后將pBeloBAC11載體線性化后插入到pUC-Fa TKAM-GFP-gpt-Fa TKB中構(gòu)建了重組病毒轉(zhuǎn)移載體pUC- Fa TKAM-GFP-gpt-Fa TKB-BAC。將PRV Fa基因組DNA與重組病毒轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，經(jīng)過(guò)3輪gpt加壓篩選和4輪噬斑篩選得到了純化的帶BAC質(zhì)粒的重組偽狂犬病毒rPRV-Fa-BAC。將純化的重組病毒 rPRV-Fa-BAC感染Vero細(xì)胞，適時(shí)提取環(huán)狀的重組病毒基因

5、組DNA，電轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)BamHⅠ酶切鑒定篩選BAC分子化克隆，將陽(yáng)性BAC克隆轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞得到拯救的重組病毒vPRV-BAC-Fa。重組病毒vPRV-BAC-Fa在Vero細(xì)胞上盲傳4代后，gpt加壓篩選標(biāo)記基因和GFP綠色熒光基因仍然存在，通過(guò)PCR檢測(cè)插入的其它外源片段對(duì)以及PRV中的關(guān)鍵基因，并選擇部分基因進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明拯救的重組偽狂犬病毒vPRV-BAC-Fa得到了穩(wěn)定的遺傳。通過(guò)對(duì)親本毒PRV