1、研究背景
　　骺板軟骨內(nèi)源性成骨過(guò)程決定肢體的長(zhǎng)度，一旦受損會(huì)影響肢體的正常發(fā)育。據(jù)統(tǒng)計(jì)16歲以下兒童長(zhǎng)骨損傷累及骺板的約占15％-30%，其中1%-2%的骺板損傷會(huì)引起骺板早閉，導(dǎo)致肢體生長(zhǎng)障礙及畸形，難以治療。目前研究認(rèn)為，內(nèi)源性成骨實(shí)際上是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞增殖與分化的過(guò)程，而這些變化都是以細(xì)胞基因精確表達(dá)的形式實(shí)現(xiàn)的。最近研究，這些基因的表達(dá)受控于microRNAs（miRNAs）。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在心肌、骨骼肌中特異性

2、高表達(dá)，能促進(jìn)其正常發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)miR-1在骺板軟骨中特異性高表達(dá)，那么miR-1是否能調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和分化，目前還不清楚。
　　故本實(shí)驗(yàn)選擇分離雞胚胸骨增殖區(qū)軟骨細(xì)胞，分別通過(guò)用外源性的miR-1及其抑制劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使miR-1過(guò)表達(dá)和相應(yīng)沉默來(lái)觀察其對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響。
　　方法
　?。?）取16日齡的雞胚，取其胸骨并分離增殖區(qū)軟骨細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)并按120nM進(jìn)行miR-1/antimiR-1及

3、其對(duì)照劑的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。（2）通過(guò)Elisa技術(shù)檢測(cè)蛋白多糖、Ⅱ型膠原、MMP-13及TIMP-1在蛋白水平上變化，觀察過(guò)表達(dá)/沉默miR-1對(duì)軟骨細(xì)胞表型維持的影響。（3）利用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后，不同時(shí)間點(diǎn)miR-1對(duì)軟骨細(xì)胞增殖能力的影響；同時(shí)對(duì)軟骨細(xì)胞增殖明顯的時(shí)間點(diǎn)利用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)其進(jìn)一步驗(yàn)證。（4）通過(guò)Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、Sox9、Ihh以及MMP-13等指標(biāo)的變化，在基因水平上觀察過(guò)表達(dá)/沉

4、默miR-1對(duì)軟骨細(xì)胞表型維持、增殖和分化的影響。
　　結(jié)果
　　分離培養(yǎng)雞胚胸骨增殖區(qū)軟骨細(xì)胞，以1×105/ml的密度接種在6孔板中在37℃恒溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)70%的融合后進(jìn)行miR-1/antimiR-1及其對(duì)照劑的轉(zhuǎn)染。（1）軟骨細(xì)胞增殖：①軟骨細(xì)胞表型維持：Realtime-PCR檢測(cè)：miR-1過(guò)表達(dá)Ⅱ型膠原和Sox9等指標(biāo)在基因水平上表達(dá)量增加；而MMP-13在基因水平上表達(dá)下降（P﹤0.05）。抑制miR

5、-1后，Ⅱ型膠原和Sox9等指標(biāo)在基因水平上表達(dá)量下降；而MMP-13在基因水平上表達(dá)增加（P﹤0.05）。Elisa證明：miR-1過(guò)表達(dá)蛋白多糖、Ⅱ型膠原及TIMP-1在蛋白水平表達(dá)增高；MMP-13在蛋白水平表達(dá)降低（P﹤0.05）。而抑制miR-1后，蛋白多糖、Ⅱ型膠原及TIMP-1在蛋白水平表達(dá)降低；MMP-13在蛋白水平表達(dá)增高（P﹤0.05）。②軟骨細(xì)胞增殖：CCK-8技術(shù)顯示：miR-1過(guò)表達(dá)能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖（P﹤0

6、.05），而抑制miR-1后，軟骨細(xì)胞的增殖能力下降（P﹤0.05）。流式細(xì)胞技術(shù)驗(yàn)證：miR-1過(guò)表達(dá)使處于S期、G2期的細(xì)胞明顯增加，而抑制miR-1后，處于S期、G2期的細(xì)胞顯著下降（P﹤0.05）。（2）軟骨細(xì)胞分化：Realtime-PCR檢測(cè)：miR-1過(guò)表達(dá)：Ⅱ型膠原、Sox9和Ihh的基因表達(dá)顯著上調(diào)；而Ⅹ型膠原的表達(dá)顯著下降（P﹤0.05）。而抑制miR-1后，Ⅱ型膠原、Sox9和Ihh的基因表達(dá)顯著下降；而Ⅹ型膠原的