1、寄生蜂是重要的農(nóng)業(yè)害蟲天敵，在生物防治中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用，寄生蜂在產(chǎn)卵過程中，伴隨有將毒液、多分DNA病毒、類病毒顆粒等寄生因子一并注入寄主體內(nèi)，通過調(diào)控寄主免疫反應(yīng)和寄主的生長發(fā)育，以確保其后代能夠在寄主體內(nèi)正常發(fā)育。蝶蛹金小蜂（Pteromalus puparum）是十字花科蔬菜害蟲菜粉蝶蛹期優(yōu)勢內(nèi)寄生蜂，其僅含有毒液一種寄生因子。目前對蝶蛹金小蜂毒液蛋白已經(jīng)鑒定明確60個(gè)蛋白組分，并分為蛋白酶類、蛋白酶抑制劑、識別或結(jié)合蛋白、

2、其他及功能未知蛋白五大類（王磊，2012），本論文主要研究蝶蛹金小蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑PpSPN4和PpSPN6的基因克隆與表達(dá)模式。
　　1.蝶蛹金小蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑PpSPN4的基因克隆與表達(dá)模式分析通過3'和5'RACE克隆得到蝶蛹金小蜂的PpSPN4的cDNA全長。PpSPN4的cDNA序列全長2623bp，開放式閱讀框(ORF)長1923bp，共編碼641個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為72.3 kDa，通過SignalP分析

3、，前23個(gè)氨基酸為信號肽。將去信號肽的PpSPN4的氨基酸全序列與其他物種中的serpin序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，PpSPN4和麗蠅蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)的serpin4（XM_001603896.2）相似性最高。構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28a-PpSPN4并在自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示pET28a-PpSPN4能在大腸桿菌中大量表達(dá)。通過對PpSPN4在

4、蝶蛹金小蜂頭、胸、腹（不包括毒囊毒腺和卵巢）、卵巢、毒囊毒腺各組織中的表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR與Western blot分析，明確該基因在毒囊毒腺中高表達(dá)。對蝶蛹金小蜂雌蜂毒液絲氨酸蛋白酶抑制劑PpSPN4進(jìn)行時(shí)間表達(dá)分布分析。Western blot結(jié)果表明PpSPN4在不同時(shí)期毒液中都有表達(dá)，在羽化后6天內(nèi)，蛋白含量出現(xiàn)了兩個(gè)高峰期，分別為羽化后第4天與羽化后第6天;定量PCR結(jié)果表明，該基因在羽化第1天和羽化后第5天分別出現(xiàn)

5、兩次轉(zhuǎn)錄高峰期。
　　2.蝶蛹金小蜂絲氨酸蛋白酶抑制劑PpSPN6的基因克隆與表達(dá)模式分析結(jié)合RACE技術(shù)與本地BLAST分析，克隆獲得蝶蛹金小蜂的PpSPN6的cDNA全長。PpSPN6的cDNA全長1806 bp，ORF長1197bp，共編碼399個(gè)氨基酸，前19個(gè)氨基酸為信號肽，預(yù)測分子量為44.1kDa。將去信號肽的PpSPN6的氨基酸全序列與其他物種中的serpin序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析知PpSPN6和

6、麗蠅蛹集金小蜂的serpin3/4(XP_008201843.1)、alaserpin(XP_008201838.1)相似性最高。構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28a-PpSPN6并在自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下，SDS-PAGE結(jié)果顯示pET28a-PpSPN6能在大腸桿菌中大量表達(dá)。對蝶蛹金小蜂雌蜂頭、胸、腹（不包括毒囊毒腺和卵巢）、卵巢、毒囊毒腺各組織中該基因的表達(dá)情況進(jìn)行半定量PCR和Western blot分析，基因PpSPN6雌蜂毒囊毒