1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗稱綠膿桿菌，屬革蘭陰性桿菌，廣泛分布于水、空氣、土壤及醫(yī)院環(huán)境中，同時也是人體的正常菌群。本菌的感染多見于皮膚粘膜受損部位，如燒傷、創(chuàng)傷等，也見于因長期化療或使用免疫抑制劑的患者。在醫(yī)源性感染中由本菌引起者約占10％，在某些特殊病房中，如燒傷和腫瘤病房、各種導管和內窺鏡的治療與檢查室內，本菌感染率可高達30％。它是一種能引起急慢性感染的機會致病菌，特別是引起肺部感染。它

2、是引起囊性肺纖維化、彌漫性泛支氣管炎及支氣管擴張癥等病人死亡的主要病原體。由于其對抗生素的耐藥性使其感染幾乎不可能被清除而導致肺衰竭最終導致死亡。這促使人們開始致力于研究其感染的機制，從而從根本上尋找新的抗感染途徑。
　　 近年來的研究發(fā)現(xiàn)細菌可以根據(jù)特定信號分子的濃度來監(jiān)測周圍環(huán)境中自身的數(shù)量變化，當信號分子達到一定的閾值濃度時,可與相應受體結合，激活菌體中相關基因的表達來適應環(huán)境中的變化,完成這一信號傳導的普遍存在于革蘭陰性

3、菌和革蘭陽性菌中的系統(tǒng)被稱為細菌密度感知信號 (Quorum-sensing，QS)系統(tǒng)。在革蘭陰性菌中，對QS系統(tǒng)研究最為深入的是銅綠假單胞菌，該菌的信號系統(tǒng)在調控銅綠假單胞菌各種毒力因子表達中起重要作用。隨著對該系統(tǒng)的深入研究，已經證實細菌細胞間信號系統(tǒng)是由參與毒力基因表達的調控多基因組成的，同時也明確了細胞間信號系統(tǒng)基因群是一個復雜的級聯(lián)系統(tǒng)。這個級聯(lián)系統(tǒng)包括兩個主要的轉錄調節(jié)因子lasR和rhlR和幾個其它組成元素。近年來又發(fā)現(xiàn)

4、了銅綠假單胞菌的由QS系統(tǒng)控制并且調控lasB的轉錄的喹諾酮信號級聯(lián)系統(tǒng)。
　　 目前的研究成果表明，Las系統(tǒng)在銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)中位于信號級聯(lián)系統(tǒng)的頂層。LasR-3-oxo-C12-HSL復合物可以正向調控rhlR和rhlI的轉錄；喹諾酮信號系統(tǒng)中的醌類物質(PQS)是連接Las系統(tǒng)和Rhl系統(tǒng)的紐帶。不論在哪一個細胞間信號系統(tǒng)中，Las系統(tǒng)均處于中心地位。當細菌密度較低的時候，僅產生基礎水平的3-oxo-C12-HSL

5、，當密度升高時，3-oxo-C12-HSL亦隨之升高直至閾值濃度，此時3-oxo-C12-HSL便和LasR結合，LasR-3-oxo-C12-HSL復合體主導網(wǎng)絡調控并激活下游特定基因的轉錄，從而激活包括綠膿菌素等在內的一系列致病因子的表達。近年來已有研究提示密度感知系統(tǒng)本身就可能是一種毒力因子，并且可以直接作用于宿主細胞，抑制宿主免疫反應，從而導致機體更易于被感染。綜合以前學者的研究討論工作，強烈提示信號分子能夠改變銅綠假單胞菌感染

6、后的宿主免疫反應并可能是宿主免疫應答反應的重要調節(jié)因子。
　　 宿主體內存在著比較完善的免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)由免疫器官、免疫細胞以及免疫分子組成。在感染免疫過程中，各免疫器官、組織、細胞和免疫分子間互相協(xié)作、互相制約、密切配合，共同完成復雜的免疫防御功能。而致病菌侵入人體后，首先遇到的是固有免疫功能的抵御。固有免疫主要由組織屏障和某些免疫細胞、免疫分子等組成。而巨噬細胞作為機體重要的分泌細胞因子的固有免疫應答細胞，具有吞噬顆粒性抗原

7、及吞飲可溶性抗原的作用。此外，巨噬細胞作為炎癥階段的主要吞噬細胞，負責清除機體損傷處組織和細胞的壞死碎片以及病原體等，這些物質對創(chuàng)傷愈合過程都有重要的調控作用。因此，巨噬細胞的活化對于機體早期抗感染免疫具有一定作用。故以巨噬細胞凋亡和吞噬等細胞行為學變化為研究靶點，可成為篩選和開發(fā)新型免疫調節(jié)藥物的新策略。我們通過化學合成銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL分子，觀察其對小鼠巨噬細胞株RAW264.7的基本生物效應，

8、為進一步研究細菌與宿主之間相互作用提供初步實驗依據(jù)。
　　 本研究工作分以下二個部分：
　　 一、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞活力及凋亡影響的檢測1、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞活力影響的檢測挑選一瓶狀態(tài)好的細胞用0.25％的胰酶消化吹打混勻成密度約為8×106/ml的細胞懸液，以200μL/孔

9、的量接種到96孔培養(yǎng)板中（周邊孔用PBS填充）37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，細胞貼壁生長，將孔板中的培養(yǎng)基棄去，加入不含胎牛血清的DMEM200μL/孔，各孔分別加入信號分子3-oxo-C12-HSL 使其終濃度為100,50,25,12.5,6.25μM及對照孔（加等量的DMSO），每組設6個復孔，信號分子3-oxo-C12-HSL作用2h或4h后吸去孔中培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，然后加入180μL/孔不含胎牛血清的DMEM并同

10、時加入20μL/孔 MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h,4h后將上清棄去，每孔加入DMSO150μL，低速振蕩10min，使結晶充分溶解后在酶標儀上測各孔的OD490nm。通過得到的各孔OD值的大小間接反映各孔細胞的活力。
　　 2、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞凋亡的影響挑選一瓶狀態(tài)好的細胞用0.25％的胰酶消化吹打混勻成密度合適的細胞懸液(8×106/ml)，以3ml/孔的量接

11、種到6孔板中37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，細胞貼壁生長，將孔板中的培養(yǎng)基棄去，加入新鮮的培養(yǎng)基同時加入信號分子3-oxo-C12-HSL使其終濃度為100,50,25,12.5,6.25μM及對照孔（加等量的DMSO），作用4h后按照Annexin Ⅴ-FITC/PI雙標凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）及Caspase 3,8,9活性檢測試劑盒說明操作，分別上流式、酶標儀或熒光顯微鏡檢測結果，比較不同濃度信號分

12、子引起細胞的凋亡情況。
　　 二、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞吞噬功能的影響1、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞吞飲中性紅的影響挑選一瓶狀態(tài)好的細胞用0.25％的胰酶消化吹打混勻成密度約為8×106/ml的細胞懸液，以200μL/孔的量接種到96孔培養(yǎng)板中（周邊孔用PBS填充）37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2

13、h后細胞貼壁，加入信號分子3-oxo-C12-HSL 使其終濃度為100,50,25,12.5,6.25μM及對照孔（加等量的DMSO），繼續(xù)孵育2h，棄去培養(yǎng)基加入中性紅生理鹽水（0.7％）200μL/孔37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中孵育1h，用PBS洗三次，然后加入細胞裂解液200μL/孔，4℃過夜。酶標儀測定各孔的OD490nm。間接反映各孔細胞對中性紅的吞飲能力。
　　 2、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-

14、HSL對小鼠巨噬細胞株RAW264.7吞噬銅綠假單胞菌的影響挑選一瓶狀態(tài)好的細胞用0.25％的胰酶消化吹打混勻成密度合適的細胞懸液（8×106/ml），以3ml/孔的量接種到6孔板中37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，細胞貼壁生長，將孔板中的培養(yǎng)基棄去，加入新鮮的培養(yǎng)基同時加入信號分子3-oxo-C12-HSL使其終濃度為100,50,25,12.5,6.25μM及對照孔（加等量的DMSO），作用2h，然后加入0.2ml/孔的PAO1

15、生理鹽水銅綠假單胞菌懸液（銅綠假單胞菌數(shù)量與細胞數(shù)的比例約為100:1），與細胞37℃共孵育1h后用PBS充分洗三次，瑞氏染色后在油鏡下觀察計數(shù)分別得到吞噬率和吞噬指數(shù)。
　　 結論：本研究通過對加不同濃度3-oxo-C12-HSL后的小鼠巨噬細胞的形態(tài)學、細胞膜、線粒體、caspase酶活性及其吞噬能力的變化，說明銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細胞株RAW264.7具有免疫抑制作用，可以降低