1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)是一種在土壤中廣泛分布的革蘭氏陽性細(xì)菌，在芽胞形成期產(chǎn)生的晶體蛋白對許多昆蟲有毒力，因而被廣泛用作害蟲的生物防治。近些年來發(fā)現(xiàn)其對線蟲也有毒力。本文從蘇云金芽胞桿菌對植物寄生線蟲的防治效果、殺線蟲晶體蛋白基因表達(dá)調(diào)控和晶體蛋白對植物寄生線蟲的作用方式等方面研究了蘇云金芽胞桿菌對植物寄生線蟲的作用。 1.測定了蘇云金芽胞桿菌YBT-1532菌株對根結(jié)線蟲毒力及防治效果。該

2、菌株攜帶有編碼130kDa晶體蛋白的殺線蟲基因cry1Ea6，同時該菌株還產(chǎn)生豐富的蘇云金素，也對線蟲有很高的毒力。分別測定該菌株產(chǎn)生的晶體蛋白和蘇云金素對北方根結(jié)線蟲(Meloidogynehapla)二期幼蟲的毒力，發(fā)現(xiàn)它們都表現(xiàn)出了很高的毒力，其LC50分別為19.32μg/mL和25.87μg/mL。同時，我們還測定了在盆栽條件下該菌株對北方根結(jié)線蟲的防治效果。結(jié)果顯示，在盆栽條件下該菌株可以有效抑制北方根結(jié)線蟲對番茄的感染、降

3、低根組織上根結(jié)數(shù)量、產(chǎn)卵量以及土壤中的蟲口密度。我們還進(jìn)行了防治花生根結(jié)線蟲(M.arenria)的田間初步實(shí)驗(yàn)，該菌株對花生根結(jié)線蟲并沒有表現(xiàn)出明顯的防治效果，但是可以使花生增產(chǎn)6％左右。 2.在殺線蟲晶體蛋白基因cry6Aa2操縱子中發(fā)現(xiàn)了一個負(fù)調(diào)控因子。在cry6Aa2基因下游還有一個基因orf2，兩基因之間存在一個莖環(huán)。處在兩基因之間的莖環(huán)抑制orf2的表達(dá)，使之處于一個相對較低的表達(dá)水平。當(dāng)突變orf2時，cry6Aa

4、2基因表達(dá)量明顯提高；當(dāng)在出發(fā)菌株YBT-1518中突變orf2基因時，cry6Aa2的表達(dá)水平也顯著提高；當(dāng)去掉莖環(huán)結(jié)構(gòu)時，orf2得到大量表達(dá)，cry6Aa2表達(dá)水平急劇降低，這預(yù)示著orf2對cry6Aa2基因的表達(dá)有負(fù)向調(diào)控作用。同時EMSA實(shí)驗(yàn)還表明orf2表達(dá)的蛋白質(zhì)能結(jié)合到莖環(huán)上。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在克隆的操縱子當(dāng)中，莖環(huán)抑制調(diào)節(jié)基因orf2的表達(dá)，而調(diào)節(jié)基因orf2表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)合到莖環(huán)上，這可能打開莖環(huán)，從而影響了cr

5、y6Aa2基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的穩(wěn)定性，因而降低了cry6Aa2的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對cry6Aa2表達(dá)的負(fù)向調(diào)控。在蘇云金芽胞桿菌中，存在著許多正向調(diào)節(jié)因子來提高殺蟲晶體蛋白基因的表達(dá)，而像本研究中orf2這種負(fù)向調(diào)節(jié)因子還比較少見。本研究發(fā)現(xiàn)了一個新的晶體蛋白基因表達(dá)負(fù)向調(diào)控模式，為提高晶體蛋白表達(dá)量提供了一條新的途徑。 3.初步研究了晶體蛋白進(jìn)入根結(jié)線蟲體內(nèi)的方式。由于植物寄生線蟲大多專性寄生，主要依靠其刺吸式口器-口針從植物

6、細(xì)胞內(nèi)吸取細(xì)胞內(nèi)含物的方式來取食，晶體蛋白很難通過其口針直接進(jìn)入體內(nèi)。但是許多研究結(jié)果表明，伴胞晶體蛋白的確能夠?qū)χ参锛纳€蟲表現(xiàn)出毒力，那么，蘇云金芽胞桿菌晶體蛋白是如何進(jìn)入植物寄生線蟲體內(nèi)并且發(fā)生毒力作用的呢?本文以北方根結(jié)線蟲為作用對象，Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)溶解的晶體蛋白毒素Cry6Aa2的確可以通過某種方式進(jìn)入根結(jié)線蟲體內(nèi)，并且與線蟲體內(nèi)的毒素受體結(jié)合，使得毒素分子量明顯增加；而用CrySB毒素感染根結(jié)線蟲，從線蟲體內(nèi)

7、也能檢測到該蛋白，但是發(fā)現(xiàn)該蛋白被降解成大約70kDa，這也表明兩種典型的殺線蟲晶體蛋白Cry6A和Cry5B對線蟲的作用方式有差異。用對線蟲無毒力的小分子量蛋白Cry51Aa1作用根結(jié)線蟲時，同樣能從其體內(nèi)檢測到該蛋白，但是分子量沒有任何變化。用羅丹明標(biāo)記的Cry6Aa2毒素作用根結(jié)線蟲，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，熒光信號首先出現(xiàn)在線蟲體表，隨著作用時間的延長，線蟲體內(nèi)才開始出現(xiàn)熒光，而且熒光信號從最初的彌散狀態(tài)逐漸集中到其腸道組