1、銅綠假單胞菌是嚴(yán)重?zé)齻?chuàng)傷、囊性纖維病變及晚期腫瘤患者死亡的重要原因，嚴(yán)重危害著人類的健康。而銅綠假單胞菌感染的治療一直比較棘手，因該菌可通過多種途徑對許多常用抗菌藥物產(chǎn)生多重耐藥性，如產(chǎn)生碳青霉烯類酶、改變抗菌藥物作用的靶位、丟失外膜孔蛋白、表達(dá)多種藥主動外排系統(tǒng)及形成生物膜等。而現(xiàn)有抗生素的作用范圍主要是針對細(xì)菌細(xì)胞壁、DNA和蛋白質(zhì)的生物合成過程中的某一個(gè)關(guān)鍵分子，如針對DNA合成的靶點(diǎn)只有DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶。[1]因此，迫切需要

2、尋找抗銅綠假單胞菌藥物作用的新靶點(diǎn)，以篩選新型抗生素更好地解決現(xiàn)有細(xì)菌的耐藥性問題。于是，我們把目光投向了細(xì)菌在自然界中的天敵--噬菌體。
　　 噬菌體是細(xì)菌的病毒，是一種非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生命體，因此它進(jìn)入宿主菌后必須利用宿主菌大分子合成機(jī)制和能量裝置進(jìn)行自身的復(fù)制，這是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，涉及了眾多的調(diào)控機(jī)制。在漫長的進(jìn)化歷程中，噬菌體發(fā)展出一套獨(dú)特的機(jī)制來限制宿主菌的生長與繁殖，即噬菌體基因組編碼產(chǎn)生某些特殊的蛋白分子，可與宿主

3、菌生長、代謝的重要調(diào)控性蛋白結(jié)合，并使其鈍化，從而阻斷宿主的生長與繁殖，將宿主菌大分子合成機(jī)制和能量裝置轉(zhuǎn)向噬菌體自身的復(fù)制與增值，這就是所謂的“關(guān)閉宿主”功能(shut-off functions)[2]。
　　 目前研究表明，噬菌體編碼的蛋白與宿主蛋白間的相互作用在“關(guān)閉宿主”功能方面發(fā)揮了十分重要的作用，主要涉及噬菌體編碼的某些蛋白分子與宿主菌的分裂、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯相關(guān)因子的相互作用。到目前為止，對已經(jīng)完成測序的6

4、00多種噬菌體基因組序列分析表明，很大一部分預(yù)測的ORFs與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列無相似性；即使是人們研究最多的T4噬菌體，也有超過一半的ORF功能沒有明確?？梢姡覀兯莆盏幕蚪M數(shù)據(jù)顯示絕大部分噬菌體與宿主間的相互作用還不被人們所了解。而在而在噬菌體對宿主菌的整個(gè)感染過程中，噬菌體的早期基因表達(dá)至關(guān)重要，決定著整個(gè)感染周期的進(jìn)展。因此本課題擬充分利用銅綠假單胞菌噬菌體基因組資源，通過二維電泳-質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和基因芯片鑒定噬菌

5、體早期蛋白表達(dá)以及相應(yīng)的宿主基因表達(dá)的變化，進(jìn)一步初步鑒定出與噬菌體早期蛋白相互作用的宿主菌蛋白。本課題的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.銅綠假單胞菌噬菌體PaP3感染宿主菌PA3后蛋白質(zhì)譜的表達(dá)變化：利用二維電泳-質(zhì)譜技術(shù)分別在PaP3感染宿主后5min，10min，20min，30min，80min，120min，200min幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測PaP3與宿主所產(chǎn)生的差異表達(dá)蛋白。經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)與歸類分析，我們初步鑒定出22個(gè)宿主被抑

6、制蛋白(主要包括核糖體蛋白、翻譯延伸因子、鞭毛相關(guān)蛋白及分子伴侶)，15個(gè)宿主被誘導(dǎo)蛋白(主要涉及能量合成、糖、脂代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白質(zhì))及12個(gè)噬菌體自身表達(dá)蛋白(主要為結(jié)構(gòu)蛋白及未知功能蛋白)。
　　 2.PaP3全基因組在感染宿主菌PA3過程中的分時(shí)期表達(dá)：利用基因芯片檢測噬菌體PaP3在感染宿主菌PA3后不同時(shí)間其全基因組在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)譜變化，并進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類(hierarchical clustering)分析。利

7、用蛋白質(zhì)合成抑制劑氯霉素(Cm)和DNA復(fù)制抑制劑磷酸乙酸(PAA)實(shí)驗(yàn)確定PaP3全基因組的分時(shí)期表達(dá)情況。結(jié)果表明，根據(jù)時(shí)間表達(dá)模式的不同，PaP3全基因組可分為三大類：15個(gè)早期基因(ORF71-57)、35個(gè)中期基因(ORF56-22)及21個(gè)晚期基因(ORF21-1)。在PaP3基因組結(jié)構(gòu)中，這三類基因各自串聯(lián)分布且可能受不同的操縱子調(diào)控。
　　 3.PaP3感染后宿主菌PA3的基因表達(dá)變化：利用基因芯片技術(shù)考察了PA

8、3被PaP3感染后5min全基因組表達(dá)的變化，通過SAM分析、主成份分析、相關(guān)性分析、GoTermPie Picture分析、及差異基因的功能分類等分析，結(jié)果顯示PA3的部分未知功能基因與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)水平在被PaP3感染后顯著下調(diào)，提示噬菌體感染早期可能對宿主菌的基因表達(dá)進(jìn)行全局性調(diào)控，其中可能涉及噬菌體早期編碼基因產(chǎn)物與宿主的相互作用。
　　 4.根據(jù)蛋白質(zhì)譜及基因表達(dá)譜分析選擇若干噬菌體早期蛋白(ORF66-71)，構(gòu)

9、建細(xì)菌雙雜交誘餌質(zhì)粒，利用細(xì)菌雙雜交技術(shù)篩選PA3基因組表達(dá)文庫質(zhì)粒，鑒定出可與噬菌體早期蛋白ORF66、ORF70相互作用的宿主菌蛋白124-PA2426、133-PA3351及133-PA3622。
　　 綜上所述，通過蛋白質(zhì)譜及全基因組表達(dá)譜分析，我們對噬菌體感染宿主有了一個(gè)較為宏觀的認(rèn)識，初步確定PaP3感染過程中其早期、中期及晚期基因隨時(shí)間有序表達(dá)，且宿主菌的基因表達(dá)在噬菌體感染早期即受到全局性調(diào)控；并從宏觀落實(shí)到微觀