1、[研究目的]
　　 探討淫羊藿素通過(guò)誘導(dǎo)活化型肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells，HSCs)的生長(zhǎng)抑制和凋亡，延緩大鼠肝纖維化進(jìn)程的作用和機(jī)制。
　　 [研究方法]
　　 體外實(shí)驗(yàn)：以不同濃度的淫羊藿素及其溶劑分別處理肝星狀細(xì)胞系HSC-T6(大鼠)、LX-2(人)和正常人肝細(xì)胞系，應(yīng)用噻唑藍(lán)測(cè)定各受試細(xì)胞的生長(zhǎng)周期變化。應(yīng)用流式細(xì)胞儀及AnnexinV-FITC染色試劑盒等技術(shù)檢測(cè)淫羊藿素

2、對(duì)HSCs的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。并采用全基因組表達(dá)譜芯片對(duì)淫羊藿素處理后的HSC-T6以及溶劑處理的HSC-T6進(jìn)行全基因組表達(dá)譜的比較分析，初步檢測(cè)淫羊藿素作用下HSCs凋亡的相關(guān)通路。并通過(guò)Real-time PCR及Western blot檢測(cè)淫羊藿素處理后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-12、caspase-3和BAX的表達(dá)，以初步探索淫羊藿素抗肝纖維化作用及誘導(dǎo)活化型HSCs凋亡的分子機(jī)制。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：通過(guò)膽總管結(jié)扎

3、手術(shù)(Common bile duct ligation，CBDL)以及四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)分別建立膽汁淤積性肝硬化模型和肝中毒損傷性肝硬化模型。在大鼠肝纖維化形成后，給予淫羊藿素治療(1 mg]kg體重，3次/w，持續(xù)4 w)。治療結(jié)束后，取大鼠右心室全血檢測(cè)肝功能指標(biāo)的變化，病理切片HE染色觀察肝臟損傷程度。通過(guò)免疫組化α-SMA染色分析及Western blot方法檢測(cè)肝臟纖維膠原積累

4、情況及組織內(nèi)活化型HSCs的分布和密度，并進(jìn)一步測(cè)定肝組織羥脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)含量，檢測(cè)淫羊藿素對(duì)膽汁淤積性肝纖維化和氧化損傷肝纖維化的緩解作用。各項(xiàng)數(shù)據(jù)通過(guò)(-x±s).d表示，并采用統(tǒng)計(jì)專業(yè)軟件PASW18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。顯著性差異分析采用一維方差分析的LSD多重比較及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　 體外實(shí)驗(yàn)：HSC-T6對(duì)淫羊藿

5、素反應(yīng)敏感。淫羊藿素對(duì)HSC-T6生長(zhǎng)的48 h半數(shù)抑制濃度(IC50)為12.8μmol/L。并且隨著淫羊藿素濃度的增加，生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)，具有劑量依賴性。但對(duì)正常肝細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用。淫羊藿素對(duì)活化型HSCs的生長(zhǎng)抑制主要通過(guò)誘導(dǎo)凋亡實(shí)現(xiàn)。HSC-T6與24μmol/L淫羊藿素共培養(yǎng)24 h后，凋亡率為20.19％，與正常培養(yǎng)活化型肝星狀細(xì)胞比較差異顯著(P＜0.05)。并伴隨G2期細(xì)胞消失。淫羊藿素誘導(dǎo)LX-2的凋亡趨勢(shì)更明顯

6、。全基因組表達(dá)譜芯片掃描結(jié)果顯示，淫羊藿素誘導(dǎo)活化型肝星狀細(xì)胞凋亡，顯著改變Bcl-2家族相關(guān)凋亡基因表達(dá)，并且上調(diào)Bax、caspase-3和caspase-12等蛋白表達(dá)水平，參與線粒體凋亡通路的調(diào)控。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示：與模型組比較，淫羊藿素治療組能夠降低肝纖維化時(shí)異常升高的轉(zhuǎn)氨酶水平(P＜0.05)，大鼠肝纖維化評(píng)分明顯降低(P＜0.05)。Ⅰ型膠原及α-SMA染色顯示模型組在肝內(nèi)毛細(xì)膽管附近有大量的活化型HSCs存在

7、。淫羊藿素組活化型HSCs數(shù)量(P＜0.05)、膠原蛋白及Hyp含量(P＜0.01)均顯著下降。因此，淫羊藿素可減少纖維化肝組織中活化型HSCs的數(shù)目及膠原蛋白的堆積，延緩肝纖維化進(jìn)程。淫羊藿素抗肝纖維化作用通過(guò)誘導(dǎo)活化型HSCs凋亡實(shí)現(xiàn)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、淫羊藿素可抑制體外培養(yǎng)的活化型肝星狀細(xì)胞系HSC-T6(大鼠)及LX-2(人)的生長(zhǎng)，但對(duì)正常肝細(xì)胞系生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。
　　 2、淫羊藿素可誘導(dǎo)