1、前言: 肺炎支原體(Mp)感染可引起原發(fā)性非典型肺炎、咽炎、氣管炎、支氣管炎等呼吸道疾病，嚴重者可引起復(fù)雜的肺外合并癥和致死性肺炎。其感染不僅發(fā)病率較高，且病程長，易復(fù)發(fā)。肺炎支原體感染的發(fā)病機理至今并未清楚，主要觀點趨向于肺炎支原體直接侵入呼吸道上皮細胞引起炎癥反應(yīng)和感染導致免疫紊亂反應(yīng)兩種學說。近幾年來，有不少研究者通過對數(shù)例臨床支原體肺炎患兒外周血檢測，發(fā)現(xiàn)患兒存在外周血淋巴細胞凋亡增強現(xiàn)象，且外周血淋巴細胞凋亡率與CD4

2、+細胞百分率和CD4+/CD8+細胞比值呈明顯負相關(guān)。研究報道外周血成熟淋巴細胞凋亡加速可能是引起該組患者免疫功能降低、病程長、易復(fù)發(fā)的一個重要原因。那么，Mp能否體外誘導淋巴細胞凋亡，Mp感染與CD4+T淋巴細胞凋亡的關(guān)系如何，國內(nèi)外尚未見報道。本實驗通過用不同濃度的Mp感染體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細胞，用PE-Cy5 Rat anti-Mouse CD4標記CD4+T淋巴細胞，采用AO/EB熒光染色技術(shù)和Annexin-V FITC/P

3、I流式細胞儀技術(shù)檢測總淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞的調(diào)亡情況，對Mp誘導淋巴細胞凋亡進行探討，為進一步闡明肺炎支原體感染的發(fā)病機理奠定基礎(chǔ)。 實驗方法: 一、肺炎支原體的培養(yǎng) 將本實驗室保存的肺炎支原體菌株復(fù)蘇后接種于支原體液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，顯微鏡下觀察到有支原體生長即作傳代培養(yǎng)。 二、淋巴細胞獲取 選用體重為20克左右的昆明小鼠，無菌取脾，用塑料針芯輕輕擠壓，磨碎脾臟，收集細胞懸液，離心棄上

4、清，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，PBS洗兩次，用RPMI-1640培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)節(jié)至1×106/ml。 三、凋亡的誘導 取對數(shù)生長期的肺炎支原體菌液，高速離心獲取菌體沉淀，PBS洗兩次，用紫外線分光光度法進行Mp蛋白定量來確定Mp濃度。將脾淋巴細胞接種在24孔組織培養(yǎng)板上，分別加入不同濃度(50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml和300μg/ml)的Mp懸液，同時設(shè)正常細胞對照組，于37.5℃、5％CO2

5、飽和濕度條件下培養(yǎng)4小時。 四、凋亡的檢測 1、熒光顯微鏡觀察細胞凋亡的形態(tài)學改變。 2、用AO/EB熒光染色技術(shù)和和Annexin-V FITC/PI雙染流式細胞儀技術(shù)檢測分析總淋巴細胞凋亡率。 3、用PE-Cy5 Rat anti-Mouse CD4標記CD4+T淋巴細胞，Annexin-V FITC/PI流式細胞儀檢測CD4+T淋巴細胞的調(diào)亡情況。 4、所有資料用-x±s表示，各組間采用SP

6、SS軟件進行方差分析。對照組與各實驗組進行比較，各實驗組之間再進行比較。 實驗結(jié)果: 1、不同劑量Mp體外誘導鼠脾淋巴細胞4h后，經(jīng)AO/EB染色在熒光顯微鏡下可見大量桔黃色的凋亡細胞，這些細胞呈典型的凋亡形態(tài)學改變：染色質(zhì)濃縮，包膜起泡，出芽，細胞核碎裂成點狀，被染成大小不一、致密濃染的黃綠色顆粒。 2、AO/EB熒光染色及流式細胞儀二種方法檢測Mp誘導組總淋巴細胞凋亡率及CD4+T淋巴細胞調(diào)亡百分率明顯高于正