1、第一部分超聲靶向微泡破壞促進基因轉(zhuǎn)染的實驗研究
　　第一章超聲輻照對HepG2腫瘤細胞存活率影響的實驗研究
　　目的：探討治療性超聲輻照對HepG2腫瘤細胞存活率的影響，為超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的參數(shù)優(yōu)化提供依據(jù)。
　　方法：96孔培養(yǎng)板分成6區(qū)(每區(qū)4個復(fù)孔)種植HepG2細胞，置37℃、5％CO2培養(yǎng)，細胞貼壁12小時后，室溫下(25℃)經(jīng)培養(yǎng)板底部(探頭與培養(yǎng)板底部涂耦合劑充分接觸)分別對每區(qū)細胞進行治療性超聲輻照。輻

2、照參數(shù)采用正交設(shè)計方法，根據(jù)文獻報道的影響因素及常識選定3因素，每因素5水平(聲強：0.5 W/cm2，1.0W/cm2，1.5W/cm2，2.0 W/cm2，2.5 W/cm2；占空比：10％，20％，40％，60％，80％。輻照時間：20s，40s，60s，120s，180s)設(shè)計正交表。輻照完成后繼續(xù)培養(yǎng)24小時后行MTT(噻唑藍)實驗檢測細胞存活率，期間光學(xué)顯微鏡觀察培養(yǎng)板內(nèi)的細胞生長狀況及形態(tài)。
　　結(jié)果：超聲輻照后，當

3、聲強大于2 W/cm2任何情況及聲強為1.5 W/cm2、占空比大于60％時，細胞出現(xiàn)明顯脫壁、形態(tài)變圓、彈坑樣聚集以及脫壁細胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒和細胞碎裂等現(xiàn)象，細胞存活率大大降低。超聲聲強在0.5-1.0 W/cm2，占空比在10％-20％時，細胞存活率達90％以上。統(tǒng)計表明，聲強和占空比是影響細胞存活率的主要因素，且聲強的影響大于占空比(P<0.05)，而輻照時間并非主要影響因素(P>0.05)。
　　結(jié)論：治療性超聲的聲強和占空比

4、是影響貼壁培養(yǎng)的腫瘤細胞存活率的主要因素，是超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的主要優(yōu)化參數(shù)。
　　第二章超聲靶向微泡破壞對HepG2腫瘤細胞生存率影響的實驗研究
　　目的：探討超聲靶向微泡破壞(UTMD)對HepG2腫瘤細胞存活率的影響。
　　方法：96孔培養(yǎng)板分成6區(qū)(每區(qū)4個復(fù)孔)種植HepG2細胞，置37℃、5％CO2培養(yǎng)，細胞貼壁12小時后，室溫下(25℃)經(jīng)培養(yǎng)板底部(探頭與培養(yǎng)板底部涂耦合劑充分接觸)分別對每區(qū)細胞進行治療

5、性超聲輻照。輻照參數(shù)采用正交設(shè)計方法，根據(jù)初篩實驗結(jié)果選定選定4因素，每因素4水平設(shè)計正交表。超聲聲強：0.5 W/cm2，0.75 W/cm2，1.0 W/cm2，1.25 W/cm2；占空比：10％，20％，40％，60％；微泡濃度(v/v)：10％，20％，30％，40％；輻照時間：5s，10s，20s，40s。輻照完成后繼續(xù)培養(yǎng)24小時后行MTT(噻唑藍)實驗檢測細胞存活率，期間光學(xué)顯微鏡觀察培養(yǎng)板內(nèi)的細胞生長狀況及形態(tài)。結(jié)果：

6、超聲輻照后，細胞在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)聲強為0.5-0.75 W/cm2時，其他因素任何所選實驗水平，細胞形態(tài)均無明顯改變；聲強為1.0 W/cm2，占空比40％，輻照時間為40秒，微泡濃度30％時，可觀察到部分細胞膜內(nèi)陷現(xiàn)象；聲強為1.0 W/cm2，占空比60％，輻照時間為40秒，微泡濃度30％時，可觀察到有小片狀細胞脫壁現(xiàn)象；聲強為1.25 W/cm2，占空比60％，輻照時間40秒，微泡濃度40％時，可觀察到脫壁細胞的區(qū)域明顯變

7、多變大。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在微泡濃度為30％時，聲強為1.0 W/cm2或以下，占空比為20％及以下，輻照時間在20秒及以下時，細胞存活率可保持在90％以上(P<0.05)。
　　結(jié)論：UTMD處理HepG2腫瘤細胞時，微泡濃度為30％(v/v)及以下，聲強為1.0 W/cm2或以下，占空比為20％及以下，輻照時間在20秒及以下等條件參數(shù)是能確保細胞存活率大于90％的優(yōu)化參數(shù)。
　　第三章超聲介導(dǎo)微泡聯(lián)合聚乙烯亞胺基因轉(zhuǎn)染Hep

8、G2細胞的實驗研究
　　目的：探討超聲(US)靶向微泡(MB)破壞(UTMD)聯(lián)合聚乙烯亞胺基因轉(zhuǎn)染HepG2細胞的效果。
　　方法：在前兩章研究的基礎(chǔ)上，確定超聲聲強與占空比的參數(shù)分別為1.0 W/cm2和20％。通過析因設(shè)計，確定微泡濃度和輻照時間2個影響因素，各選4個水平(微泡濃度：10％，20％，30％和40％，輻照時間：10，20，30，40秒)進行實驗。采用綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒作為報告基因。HepG2細胞經(jīng)

9、胰蛋白酶消化收集后，重懸后以106/ml置入12孔培養(yǎng)板，超聲輻照從板底輻照懸浮細胞(探頭與培養(yǎng)板底部涂耦合劑)，輻照后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h后，流式細胞儀測定GFP轉(zhuǎn)染效率，PI單染后再經(jīng)流式細胞儀測細胞生存率，篩選出最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)。再用此優(yōu)化的參數(shù)條件，比較單純質(zhì)粒，質(zhì)粒+US，質(zhì)粒+MB+US，質(zhì)粒+PEI，質(zhì)粒+PEI+US及質(zhì)粒+PEI+MB+US等6種不同轉(zhuǎn)染方法的基因轉(zhuǎn)染效率與細胞生存率。
　　結(jié)果：微泡濃度在30％，輻

10、照時間為20秒時，HepG2細胞具有最大的基因轉(zhuǎn)染效率(39.5％±5.8％)，該條件下的細胞存活率達91％±2.7％。在此參數(shù)下，單純質(zhì)粒(Plasmid)，質(zhì)粒+US，質(zhì)粒+MB+US，質(zhì)粒+PEI，質(zhì)粒+PEI+US及質(zhì)粒+PEI+MB+US等6種不同轉(zhuǎn)染方法GFP轉(zhuǎn)染效率分別為0.08％±0.01％、1.7％±0.71％、8.36％±3.62％、25.63％±4.84％，29.41％±4.91％，和39.5％±5.8％，統(tǒng)計學(xué)分

11、析表明各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，細胞生存率均達到90％以上，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：UTMD聯(lián)合PEI可有效提高HepG2細胞基因轉(zhuǎn)染效率并具有滿意的細胞生存率，是有前景的基因靶向轉(zhuǎn)染方法。
　　第四章超聲靶向微泡破壞聯(lián)合聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染siRNA-survivin促進HepG2細胞凋亡的實驗研究
　　目的：探討超聲靶向微泡破壞(UTMD)聯(lián)合PEI基因轉(zhuǎn)染siRNA-survivin

12、對HepG2細胞凋亡的影響。
　　方法：根據(jù)RNA干擾設(shè)計原則，人工合成2對survivin基因的特異性的寡核苷酸片段，然后將其克隆到siRNA干擾質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo，構(gòu)建針對survivin基因的干擾質(zhì)粒psiRNA-S-55和psiRNA-S-387，利用UTMD聯(lián)合PEI基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將其轉(zhuǎn)染HepG2細胞，并設(shè)立空白對照組和陰性質(zhì)粒對照組，轉(zhuǎn)染48小時后，收集細胞進行RT-PCR半定量檢測survivin m

13、RNA水平，western boltting檢測survivin蛋白含量，并用流式細胞儀檢測siRNA-survivin對HepG2細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：siRNA-survivin質(zhì)粒構(gòu)建后經(jīng)測序鑒定表明序列與預(yù)先設(shè)計的序列完全一致。RT-PCR檢測表明psiRNA-S-55組與psiRNA-S-387組survivin mRNA表達水平顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，以后者更明顯(P<0.05)。West

14、ern Blot檢測結(jié)果表明，psiRNA-S-55組與psiRNA-S-387組的HepG2細胞survivin蛋白表達受到明顯抑制(P<0.01)，以psiRNA-S-387組抑制作用最強(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，各組間內(nèi)參基因的表達未見明顯差別，結(jié)果與RT-PCR相符。細胞凋亡檢測也表明，psiRNA-S-55與psiRNA-S-387組均檢測到腫瘤細胞凋亡，以后者最為明顯，差異具

15、有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：運用UTMD聯(lián)合PEI基因轉(zhuǎn)染方法對HepG2腫瘤細胞進行survivinRNA干擾治療可有效促進細胞凋亡，是一種有潛力的基因治療新方法；psiRNA-S-387促細胞凋亡作用強于psiRNA-S-55。
　　第五章超聲靶向微泡破壞聯(lián)合聚乙烯亞胺增強小鼠肌肉基因轉(zhuǎn)染的實驗研究
　　目的：探討超聲(US)靶向微泡(MB)破

16、壞(UTMD)聯(lián)合聚乙烯亞胺(PEI)轉(zhuǎn)染對小鼠肌肉基因轉(zhuǎn)染的增強效果。
　　方法：在優(yōu)化超聲輻照的聲強與輻照時間參數(shù)后，取30只Balb/c小鼠隨機分為6組，每組5只(雙后肢計共10塊脛前肌)。綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA(20μg)按下列分組與SonoVue微泡和/或PEI混合，注入小鼠后肢脛前肌內(nèi)，然后予以治療性超聲輻照(功率：2 W/cm2，占空比：50％)。A組：PBS組(空白對照組)；B組：質(zhì)粒+US；C組：質(zhì)粒+

17、MB+US；D組：質(zhì)粒+PEI組；E組：質(zhì)粒+PEI+US組；F組：質(zhì)粒+PEI+MB+US組。10天后處死小鼠，立即取小鼠雙后肢脛前肌冰凍切片，熒光顯微鏡計數(shù)GFP陽性肌纖維數(shù)。組織同時送檢石臘切片HE染色，光鏡觀察有無炎性損傷及壞死。
　　結(jié)果：A組肌肉組織內(nèi)未見明顯綠色熒光；B組可見綠色熒光表達肌纖維，但GFP陽性纖維數(shù)較少，為14±3個；C組GFP陽性纖維個數(shù)為58±6個，D組為96±7個，E組為119±11個，F(xiàn)組為15

18、8±18個。統(tǒng)計學(xué)分析表明，B組GFP陽性的肌纖維數(shù)顯著低于C組、D組、E組和F組(P<0.01)。以F組的GFP陽性纖維數(shù)最多，與其它各組比較均有顯著差異(P<0.05)。各組石臘切片未顯示明顯的炎癥反應(yīng)和壞死。
　　結(jié)論：UTMD聯(lián)合PEI可顯著提高小鼠肌肉組織的基因轉(zhuǎn)染效率。
　　第六章超聲靶向微泡破壞聯(lián)合聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染siRNA-survivin治療裸鼠皮下腫瘤模型的實驗研究
　　目的：探討超聲(US)靶向微泡

19、(MB)破壞(UTMD)聯(lián)合PEI轉(zhuǎn)染siRNA-survivin對HepG2細胞裸鼠皮下移植瘤的基因治療效果。
　　方法：首先對30只裸鼠皮下種植HepG2腫瘤細胞，選擇種植成功的24只荷瘤裸鼠隨機分成4組，在腫瘤最大直徑為5mm時分別按下述4方案處理。(1)空白對照組，瘤內(nèi)只注入生理鹽水；(2)陰性質(zhì)粒對照組，UTMD+PEI+質(zhì)粒psiRNA-N，該質(zhì)粒不含siRNA基因序列；(3)UTMD+psiRNA-S-387質(zhì)粒組；

20、(4)UTMD+PEI+質(zhì)粒psiRNA-S-387組。超聲儀器為日本伊滕ITO-100超聲治療儀，微泡為Bracco公司的SonoVue。在第1次治療后每隔3天用藥1次，共計6次，每5天測量腫瘤體積一次。在第1次治療后的第31天小鼠安樂死，取組織送病理檢查，同時取組織行RT-PCR檢測survivin mRNA含量及western blotting檢測survivin蛋白表達水平，并采用Tunel法檢測腫瘤細胞凋亡情況。
　　結(jié)

21、果：未處理對照組及陰性質(zhì)粒組腫瘤體積較大，兩者比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。UTMD+psiRNA-S-387質(zhì)粒轉(zhuǎn)染治療組與UTMD+PEI+質(zhì)粒psiRNA-S-387治療組腫瘤的平均體積均較未處理對照組及陰性質(zhì)粒組減小，差別均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。UTMD+PEI+psiRNA-S-387質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染組腫瘤的平均體積最小，與其它各組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。RT-PCR檢測表明UTMD+psiRNA-S-387轉(zhuǎn)染組

22、和UTMD+PEI+psiRNA-S-387轉(zhuǎn)染組的survivin mRNA表達水平與未處理對照組及陰性質(zhì)粒組比較均有顯著降低(P<0.05)，以后者最低(P<0.05)。未處理對照組與陰性質(zhì)粒組無顯著差別(P>0.05)，western blotting檢測與RT-PCR結(jié)果一致。凋亡檢測表明UTMD+psiRNA-S-387轉(zhuǎn)染組和UTMD+PEI+psiRNA-S-387轉(zhuǎn)染組腫瘤細胞有較大面積的凋亡(P<0.05)，后者為最多

23、(P<0.05)。
　　結(jié)論：UTMD聯(lián)合PEI基因轉(zhuǎn)染survivin siRNA可做為HepG2腫瘤基因治療的一種有效方法，其治療效果較單用UTMD轉(zhuǎn)染更佳。
　　第二部分超聲靶向微泡破壞促進萬古霉素治療表皮葡萄球菌生物膜感染
　　第七章超聲靶向微泡破壞對表皮葡萄球菌生物膜形態(tài)影響的實驗研究
　　目的：探討超聲(US)靶向微泡(MB)破壞(UTMD)作用于細菌生物膜后對其形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，為其作為輔助抗生素治療

24、生物膜相關(guān)感染的一種方法提供理論依據(jù)。
　　方法：96孔板培養(yǎng)的24小時表皮葡萄球菌生物膜按如下4組進行超聲輻照(1)未處理對照組，無US輻照；(2)聲強0.5 W/cm2組；(3)聲強1.0W/cm2組；(4)聲強1.5W/cm2組；每組均設(shè)采用MB和不采用MB2種條件。各組US占空比均固定為50％，輻照時間均為10 min。輻照完成后生物膜經(jīng)2％結(jié)晶紫染色，用酶標儀在570nm波長處測量紫外吸收光值A(chǔ)570，并在肉眼及光顯微鏡

25、下進行形態(tài)學(xué)觀察。之后進一步選定3種條件對生物膜進行處理：(1)未處理對照組，(2)單純US處理組和(3)UTMD處理組。US聲強均為0.5 W/cm2，占空比為50％，輻照時間為30min。處理完成后生物膜分別行共聚焦激光掃描顯微鏡檢查和掃描電子顯微鏡檢查。
　　結(jié)果：無超聲輻照的對照組的無微泡與有微泡組肉眼觀察均有一層厚而致密的生物膜，光鏡下未見明顯微孔。聲強0.5 W/cm2時，肉眼觀察生物膜與對照組比較無明顯差異，但光鏡下

26、可見有很少的微孔(約1-10gm)存在。聲強1.0 W/cm2時，肉眼可觀察到約0.1mm大小的微孔，應(yīng)用微泡者孔隙明顯增大，約0.5 mm左右，光學(xué)顯微鏡下觀察則尤其明顯；聲強1.5 W/cm2時，則肉眼觀察到的微孔更多更大，約0.1-0.5 mm左右，應(yīng)用微泡者的孔隙也明顯增大，有的最大徑甚至達到1mm，不用光學(xué)顯微鏡也可觀察到。與未處理對照組比較，應(yīng)用超聲或超聲聯(lián)用微泡處理組的生物膜密度有不同程度的降低，并隨著聲強的增大，生物膜密

27、度下降也最多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同一組內(nèi)，應(yīng)用微泡+超聲處理者的生物膜密度下降又比單用US處理組又要多(P<0.05)。未處理對照組中，有MB與無MB處理的生物膜密度無明顯差別(P>0.05)。激光共聚焦掃描顯微鏡檢查顯示超聲處理后可見生物膜上微孔存在，均未發(fā)現(xiàn)US及UTMD具有直接殺菌作用。掃描電子顯微鏡觀察到單純US處理組生物膜內(nèi)細菌可見明顯變形，似有皺縮；UTMD處理組的生物膜內(nèi)細菌表面見許多小凸起，其直徑約100

28、nm至幾百nm。
　　結(jié)論：US及UTMD可導(dǎo)致細菌生物膜上微孔出現(xiàn)，生物膜密度下降，二者不具直接的殺菌作用，但生物膜內(nèi)的細菌形態(tài)發(fā)生改變，這些有利于抗生素在生物膜內(nèi)的穿透而有可能提高其抗菌活性。
　　第八章超聲靶向微泡破壞增強萬古霉素抗生物膜活性的體外實驗研究
　　目的：探討超聲(US)靶向微泡(MB)破壞(UTMD)能否增強萬古霉素的活性對抗生物膜，減少生物膜內(nèi)的存活細菌。
　　方法：96孔板培養(yǎng)的表皮葡萄球

29、菌RP62A(ATCC35984)12小時生物膜給予下述6組條件處理：(1)未處理對照組，(2)萬古霉素處理組，(3)US組，(4)萬古霉素+US組，(5)MB+US組，(6)萬古霉素+MB+US組。US參數(shù)為：聲強為1.0 W/cm2，占空比為50％，輻照時間10 min。萬古霉素劑量為100μg/ml。采用SonoVue超聲造影劑MB，濃度為30％(v/v)。生物膜處理后置37℃溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12 h，結(jié)晶紫染色后進行0D570半定

30、量檢測，并在肉眼及光學(xué)顯微鏡下對生物膜進行形態(tài)學(xué)觀察。此外，處理后的生物膜用Live/Dead染色進行共聚焦激光掃描顯微鏡觀察，了解生物膜的形態(tài)及內(nèi)部細菌存活情況。處理后的生物膜還分別刮下行CFU計數(shù)實驗，進一步對生物膜內(nèi)存活細菌進行定量檢測。
　　結(jié)果：未處理對照組和萬古霉素處理組均形成了一層較厚而致密的生物膜，US組、萬古霉素+US組、MB+US組、萬古霉素+MB+US組生物膜均可見許多大小不等的微孔，其中MB+US組和萬古霉

31、素+MB+US組生物膜微孔顯著大于US組及萬古霉素+US組，0D570半定量檢測也表明US組及萬古霉素+US組A570值顯著較未處理組和萬古霉素處理組低(P<0.01)，MB+US組和萬古霉素+MB+US組生物膜A570值又顯著較US組及萬古霉素+US組低(P<0.01)。共聚焦激光掃描顯微鏡觀察進一步證實了生物膜微孔的存在，定量分析軟件提示萬古霉素+MB+US組較萬古霉素處理組及萬古霉素+US組有更多的死菌(P<0.01)。CFU計數(shù)

32、進一步證實了上述結(jié)果。
　　結(jié)論：UTMD可有效提高抗生素活性殺滅表皮葡萄球菌生物膜內(nèi)存活菌，在生物膜相關(guān)感染治療中具有很大的應(yīng)用前景。
　　第九章超聲靶向微泡破壞增強萬古霉素抗表皮葡萄球菌生物膜的動物實驗研究
　　目的：探討超聲(US)靶向微泡(MB)破壞(UTMD)能否在動物體內(nèi)具有增強萬古霉素治療表皮葡萄球菌生物膜感染的活性。
　　方法：4只植入體外培養(yǎng)的表皮葡萄球菌RP62A(ATCC35984)生物膜感

33、染小盤的新西蘭白兔分別按以下方案進行處理，(1)未處理對照，(2)萬古霉素，(3)萬古霉素+US，(4)萬古霉素+US+MB。首次處理在生物膜體外感染盤植入24小時后開始，每天3次，每次30 min。US聲強為0.5 W/cm2，占空比50％，輻照時間20分鐘，在第4組輻照過程中，每5分鐘用27G注射器向皮下移植盤區(qū)域注射200μL SonoVue，共4次，每區(qū)共注入SonoVue為800μL。UTMD處理3天后，兔麻醉后再經(jīng)耳緣靜脈注

34、入空氣安樂死，無菌操作條件下取出移植的小盤，在超凈臺內(nèi)用滅菌牙簽小心刮下生物膜行CFU計數(shù)。
　　結(jié)果：對照組、萬古霉素組、萬古霉素+US組和萬古霉素+US+MB組的log10CFU分別為5.18±0.25、5.15±0.20、4.68±0.18和3.75±0.19。對照組、萬古霉素處理組的log10CFU差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但萬古霉素+US處理組和萬古霉素+US+MB處理組的log10CFU與前兩組的比較，差異有統(tǒng)