1、目的:利用RNA干擾技術(shù)，研究小凹蛋白（Caveolin-1）對胰島素刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(ECV304細胞)纖維蛋白溶解酶原抑制物-1（Plasminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1）表達的影響。 方法:通過Ambion專用軟件設(shè)計合成兩條編碼shRNA的互補DNA寡核苷酸單鏈,退火形成雙鏈核苷酸。通過T4連接酶將雙鏈克隆入含RNA PolIII聚合酶表達元件的pENTRTM/U6入門載體后測

2、序，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建Caveolin-1 RNAi慢病毒表達載體。運用實時定量RT-PCR、間接免疫熒光、Western-blot分析ECV304細胞Caveolin-1基因沉默效率。然后用生理濃度胰島素（終濃度1×10-9mol/L）和高濃度胰島素（終濃度1×10-7mol/L）處理ECV304細胞，檢測Caveolin-1基因沉默前后不同濃度胰島素處理的ECV304細胞中PAI-1mRNA和蛋白表達和不同濃度胰島素處理后C

3、aveolin-1mRNA和蛋白表達變化。 結(jié)果: 1.測序結(jié)果顯示插入pENTRTM/U6載體中的編碼Caveolin-1基因shRNA序列的U6RNAi盒大小及閱讀框架正確，Caveolin-1 pENTRTM/U6入門載體構(gòu)建成功。 U6上游引物與V5下游引物PCR鑒定Caveolin-1 RNAi慢病毒表達載體，瓊脂糖凝膠電泳片段與目的片段大小一致。 2、實時定量RT-PCR、間接免疫熒光、Western-blo

4、t分析入門載體、RNAi表達載體對Caveolin-1基因抑制效率達85％，且特異性較高，對無關(guān)基因如β-actin無影響，同時沉默無關(guān)基因S100A13不能干擾Caveolin-1表達。 3、高胰島素可促使PAI-1mRNA和蛋白表達明顯增加，在高胰島素刺激PAI-1表達的同時，細胞中的Caveolin-1表達明顯降低，在RNA干擾Caveolin-1基因后高胰島素促PAI-1表達的作用更加明顯；生理濃度胰島素處理ECV304

5、細胞后，PAI-1的表達增加，Caveolin-1表達無變化，shRNA誘導(dǎo)Caveolin-1沉默后生理濃度胰島素并不明顯增加PAI-1的表達。 結(jié)論: 1、成功構(gòu)建了針對Caveolin-1基因的RNAi入門載體和表達載體，能有效而又特異地抑制Caveolin-1基因表達達85％。 2、Caveolin-1可能并不參與生理狀態(tài)胰島素促 PAI-1表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，高胰島素則可能通過抑制Caveolin-1基因