1、目的：本研究旨在將中國美利奴細毛羊基因組BAC文庫分兩級構(gòu)建高質(zhì)量的三維結(jié)構(gòu)混合池,同時設(shè)計一種高通量快速PCR篩選兩級混合池的方法,為后續(xù)研究者從7.4萬個克隆中快速篩選陽性克隆,以用于綿羊基因組物理圖譜的繪制和基因的圖位克隆等研究,為其提供作圖“試劑”和克隆材料。 方法：用等級混合法構(gòu)建中國美利奴細毛羊基因組BAC文庫的三維一級混合池和二級混合池,一級混合池基于每4個384-well盤而構(gòu)建,由相同的行、列分別構(gòu)建行列的一級

2、混合池,每盤各構(gòu)建一個盤的一級混合池；將構(gòu)建好的盤一級混合池(168個)以12列×1 4行的方式排列,每行(或列)各構(gòu)建盤的二級混合池,將行(或列)標號相同的一級混合池分別混合成一個行(或列)的二級混合池。本研究中采用PCR方法篩選,采用一步篩選一個克隆或三步篩選多個克隆的策略。第一步篩選盤、行和列的二級混合池,此時可以直接確定一個陽性克隆,如果陽性克隆在兩個以上,需采用三步篩選法,即陽性盤的確定和陽性盤中的陽性行、列的確定。

3、結(jié)果：共構(gòu)建以一級盤混合池168個,一級行混合池672個,一級列混合池1008個；二級盤混合池26個(12+1.4),二級行混合池16個,二級列混合池24個。用綿羊基因組分子標記BF94-1為引物,用一步共66個PCR反應(yīng)成功篩選到一個陽性克隆。 結(jié)論：本研究所構(gòu)建的混合池至少可滿足300次PCR篩選所需。用本研究中設(shè)計的一步或三步篩選策略可高效快速的篩選出大量陽性克隆,進而為綿羊基因組物理圖譜的繪制和基因的圖位克隆等研究供作圖