1、背景：
　　肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，盡管通過(guò)手術(shù)切除和肝臟移植可以提高患者生存率，但仍然由于侵襲和轉(zhuǎn)移而高復(fù)發(fā)。腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells,CSCs)在腫瘤形成和進(jìn)展中起到重要作用,該細(xì)胞具有自我更新的能力。邊緣群細(xì)胞（side population,SP），從多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中分離出來(lái)均具有干細(xì)胞特性及表型。研究證實(shí)，SP細(xì)胞是理想的腫瘤干細(xì)胞研究的模型。MicroRNAs是調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的非編碼小RNA

2、，在多數(shù)腫瘤中充當(dāng)抑癌基因。最新研究表明，MiR-200家族不但參與調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等一系列的生命活動(dòng)過(guò)程，而且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。MiR-200a可通過(guò)與ZEB基因非編碼區(qū)3’端結(jié)合調(diào)控其表達(dá)。而ZEB可與E-鈣粘蛋白基因啟動(dòng)子結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄。本研究擬通過(guò)肝癌干細(xì)胞研究miR-200a，揭示肝癌的發(fā)生發(fā)展，為肝癌的防治提供新思路和新靶點(diǎn)。
　　目的：
　　目前microRNAs的研究主要在常規(guī)腫瘤細(xì)胞中研究

3、，在對(duì)于腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)過(guò)程中作用更重要的肝癌干性樣細(xì)胞中研究miR-200a/ZEB通路，將對(duì)干預(yù)肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)更有意義。
　　方法：
　　1、邊緣群細(xì)胞分選：選擇肝癌細(xì)胞系高、低侵襲性的MHCC-97H和Huh7細(xì)胞經(jīng)hoechst33342染色和（或）verapamil阻斷后，用FACS-III流式細(xì)胞分選儀紫外激光激發(fā)識(shí)別，分選出肝癌SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞。檢測(cè)SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞干性標(biāo)志物ALBU、KRT

4、14表達(dá)水平，確認(rèn)分選出的亞群細(xì)胞即為SP細(xì)胞。
　　2、干預(yù)miR-200a的表達(dá)對(duì)SP和非SP細(xì)胞生物學(xué)特性及EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)的影響：檢測(cè)miR-200a及下游分子ZEB的表達(dá)情況，驗(yàn)證活化效果。通過(guò)免疫組織化學(xué)、PCR技術(shù)、western-blot蛋白檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)EMT標(biāo)志分子E-cadherin、vimentin、N-cadherin的表達(dá)變化。
　　3、干

5、預(yù)ZEB表達(dá)拮抗miR-200a干預(yù)的影響:SP和非SP亞群細(xì)胞中同時(shí)干預(yù)miR-200a和ZEB的表達(dá)水平，檢測(cè)干預(yù)ZEB是否可拮抗miR-200a干預(yù)后對(duì)SP細(xì)胞惡性表型的影響。
　　4、MiR-200a/ZEB通路干預(yù)前后對(duì)SP細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響：(1)成瘤大小；(2)成瘤時(shí)間；(3)轉(zhuǎn)移灶的情況；(4)E-cadherin、vimentin、N-cadherin表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、miR-200a在肝癌

6、細(xì)胞系和肝癌組織中為低表達(dá)，并根據(jù)肝癌患者臨床病理的統(tǒng)計(jì)分析，miR-200a與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)；
　　2、通過(guò)流式細(xì)胞儀成功分選出SP細(xì)胞；
　　3、miR-200a在SP細(xì)胞中表達(dá)低于其他亞群；
　　4、調(diào)控SP細(xì)胞中miR-200a的表達(dá)后，SP細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力發(fā)生變化：體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)；
　　5、調(diào)控miR-200a后，ZEB2發(fā)生明顯變化，恢復(fù)ZEB2表達(dá)后，可以逆轉(zhuǎn)miR-200a引起的侵襲轉(zhuǎn)移