1、雞球蟲病是由艾美耳屬的一種或幾種原蟲同時或先后寄生于雞腸道黏膜細胞所引起的疾病，造成的經(jīng)濟損失巨大。實踐證明，抗球蟲藥物使用在雞球蟲的防治上具有重要作用。但抗藥性問題限制了現(xiàn)有抗球蟲藥物的廣泛應用，促使人們不得不尋找新的藥物靶標。II型脂肪酸合成代謝(Type II fatty acid biosynthesis，F(xiàn)ASII)途徑是存在于雞球蟲體內(nèi)的特殊代謝途徑，是研究開發(fā)新型抗球蟲蟲藥物的潛在靶標。本研究通過生物信息學方法，預測出雞球

2、蟲II型脂肪酸合成代謝相關(guān)酶之一-β-酮脂酰-ACP還原酶(β-ketoacyl-ACP reductase，KR)的ORF序列，進行克隆和原核表達，分析研究了其酶動力學和抑制動力學特征。實驗具體分為以下幾個部分： 首先通過生物信息學方法對柔嫩艾美耳球蟲(E. tenalla)β-酮脂酰-ACP還原酶基因(EtKR)進行預測，獲得了EtKR的ORF序列，以柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA為模板，用RT-PCR方法成功擴增出長6

3、97bp的EtKR基因部分片段；在此基礎(chǔ)之上，用RACE技術(shù)獲得EtKR基因的全長cDNA序列；測序結(jié)果表明，EtKR全長cDNA共1799bp，5'和3'非編碼區(qū)分別為247bp和508 bp，EtKR ORF長為1044bp；根據(jù)全長cDNA序列設(shè)計特異引物，成功擴增出包含整個ORF的序列片段。EtKR的ORF編碼一個由347個氨基酸組成的多肽，信號肽預測和多序列比對結(jié)果表明，其N-端包括一個由21個氨基酸組成的信號肽和79個氨基酸

4、組成的轉(zhuǎn)導肽，成熟的EtKR蛋白共由247個氨基酸組成，分子量為24.9KD。與其它物種KR的氨基酸序列相似性在35-50％之間，具有保守的三聯(lián)體催化位點(Ser-Tyr-Lys)，屬于短鏈水解還原酶家族。進化樹分析表明，EtKR與Pf KR處于同一進化枝上。預測的三級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的Rossman折疊，與Pf KR的結(jié)構(gòu)最為相似。 利用DNA重組技術(shù)，選擇不同的原核表達載體(pET-32a(+)、pMAL-c2x)，利用E.co

5、li BL21(DE3)重組表達EtKR的成熟基因片段，結(jié)果顯示兩個重組載體都能夠得到表達；但pET-32a(+)-EtKR重組表達蛋白以包涵體的形式存在，pMAL-c2x-EtKR表達蛋白大部分存在于上清中。純化pMAL-c2x-EtKR表達的重組蛋白，制備抗體，利用激光共聚焦技術(shù)研究EtKR在E.tenella子孢子內(nèi)的免疫熒光亞細胞定位。結(jié)果顯示，EtKR定位于E.tenella子孢子的頂質(zhì)體，并發(fā)現(xiàn)部分子孢子可能具有多個頂質(zhì)體。

6、 以pMAL-c2x-EtKR表達的重組蛋白進行酶動力學、酶抑制動力學分析，結(jié)果顯示，重組EtKR(rEtKR)不能利用NADPH和AcAcCoA，但是能夠與NADH發(fā)生反應，其Km值為72.9μM，這種特性是其它物種的KR所不具有的，我們推測rEtKR功能改變的原因可能是在細菌體內(nèi)重組表達過程中發(fā)生了非正確折疊，引起rEtKR空間構(gòu)象的改變，從而改變rEtKR的功能。酶抑制動力學顯示，Hexachlorophene對rEtKR