1、大豆是典型的短日植物，在光周期反應(yīng)的早期研究中被當(dāng)作模式植物。與水稻、玉米等短日植物相比，大豆的光周期反應(yīng)更加敏感，品種間的差異更大，單個(gè)品種的適應(yīng)性狹窄一直阻礙著大豆育種工作的開展。對(duì)于光周期反應(yīng)敏感的晚熟大豆品種來說，短日照不僅是成花誘導(dǎo)的必要條件，而且影響開花、結(jié)莢和鼓粒。一旦光周期條件不適，這些品種的生殖生長就會(huì)延遲，共至可從生殖生長狀態(tài)逆轉(zhuǎn)到營養(yǎng)生長狀態(tài)。對(duì)大豆光周期反應(yīng)機(jī)制的研究將為培育廣適應(yīng)的大豆晶種奠定基礎(chǔ)。本研究利用R

2、ACE技術(shù)克隆了四個(gè)大豆光周期反應(yīng)的相關(guān)基因，并通過同源比對(duì)搜索到七個(gè)相關(guān)的光周期反應(yīng)基因，利用本實(shí)驗(yàn)室長期以來建立的短日照(開花)、長日照(持續(xù)營養(yǎng)生長)、短日照一長日照(開花逆轉(zhuǎn))三位一體的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，采用Real-lime PCR技術(shù)研究了這11個(gè)基因在大豆成花誘導(dǎo)與開花逆轉(zhuǎn)中的表達(dá)，并比較了它們?cè)诠庵芷诿舾行圆煌贩N中的差異。為了進(jìn)一步驗(yàn)證與大豆光周期相關(guān)的GmSOC1基因的功能，本研究建立了利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的豆科植物百脈根高效

3、快速的轉(zhuǎn)化平臺(tái)，并將該基因轉(zhuǎn)入百脈根中驗(yàn)證了其功能。具體研究結(jié)果如下： 1.克隆了四個(gè)大豆光周期反應(yīng)的相關(guān)基因GmCOL1、GmCOL2、GmCOL3以及GmSOC1，它們分別編碼含311，365，310和211個(gè)氨基酸的蛋白。同源比對(duì)結(jié)果顯示，GmCOL1，GmCOL2， GmCOL3與豆科植物苜蓿和豌豆的CO-like基因的同源性最高；GmSOC1與擬南芥AGL20的同源性最高，達(dá)到70％，是MADS-box基因家族的一員。

4、 2.利用Real-Time PCR技術(shù)，通過對(duì)10個(gè)內(nèi)標(biāo)基因的系統(tǒng)分析，我們發(fā)現(xiàn)看家基因GmELF1B在大豆光周期反應(yīng)中較為穩(wěn)定，可用作大豆光周期相關(guān)基因表達(dá)研究的內(nèi)標(biāo)基因。 3.以GmELF1B為內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)克隆的四個(gè)大豆光周期相關(guān)基因以及通過同源比對(duì)篩選到的七個(gè)光周期相關(guān)的基因在光周期敏感品種ZGDD成花誘導(dǎo)與開花逆轉(zhuǎn)中的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這11個(gè)大豆光周期相關(guān)基因在其成花誘導(dǎo)過程中的不同光周期條件下均有表

5、達(dá)，但是長短日條件下的表達(dá)量和表達(dá)規(guī)律有所不同。它們并非特異地被短日條件誘導(dǎo)，在特定的階段，長日條件也可以誘導(dǎo)它們的表達(dá)。 4.所檢測(cè)的光周期相關(guān)基因在光周期敏感性不同的大豆品種的SAM中也均有表達(dá)，所不同的是，在光周期鈍感品種HH27中這些基因的表達(dá)峰值出現(xiàn)的時(shí)間普遍比在光周期敏感品種ZGDD中出現(xiàn)的時(shí)間早，分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果與HH27在短日條件下開花比ZGDD早的生理現(xiàn)象相符合，但是這些基因在ZGDD中的表達(dá)峰值卻比HH27

6、中高。 5.對(duì)于光周期敏感品種ZGDD而言，經(jīng)一定日數(shù)短日誘導(dǎo)后進(jìn)行長日照處理，可以產(chǎn)生花序逆轉(zhuǎn)和花逆轉(zhuǎn)，甚至整株逆轉(zhuǎn)，植株回復(fù)到營養(yǎng)生長的狀態(tài)。通過研究大豆開花相關(guān)基因在ZGDD開花逆轉(zhuǎn)中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，擬南芥分生組織特異基因LFY和AP1的同源基因GmLFY-like和GmAP1-like在逆轉(zhuǎn)條件下的表達(dá)介于短日誘導(dǎo)條件和長日抑制條件之間，說明GmLFY-like和GmAP1-like可能具有維持大豆分生組織特性的功能。而光周

7、期上游基因GmGI-like和PEBP家族基因只在逆轉(zhuǎn)早期與GmLFY-like和GmAP1-like的表達(dá)相似，說明它們可能住開花逆轉(zhuǎn)的早期發(fā)揮作用。 6.與擬南芥中的基因相似，大豆的光周期相關(guān)基因也呈現(xiàn)24小時(shí)的日變化規(guī)律，GmGI-like在長短日條件下的表達(dá)與擬南芥在長日下的表達(dá)模式相近而與水稻不同；GmCO-like的日變化與水稻Hd1和擬南芥CO均不同，但其在短日條件下的日變化與擬南芥COL1和COL2在長日下的日變

8、化規(guī)律相似；大豆PEBP家族基因在短日下的日變化又與水稻短日下的日變化相似，但長日下的日變化卻不相同，說明光周期凋控大豆相關(guān)基因?qū)θ臻L的響應(yīng)機(jī)制可能與長日雙子葉植物擬南芥以及短日單子葉植物水稻均不同。 7.結(jié)合發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的高效性與百脈根品種“Superroot”簡(jiǎn)單、快速的再生體系，本研究建立了一個(gè)快速、高效的轉(zhuǎn)化平臺(tái)用于豆科植物基因功能的研究。轉(zhuǎn)基因百脈根植株可在兩個(gè)半月內(nèi)獲得，分子生物學(xué)檢測(cè)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因事件的發(fā)

9、生。同時(shí)，利用雙元轉(zhuǎn)化載體pGFPGUSPlus對(duì)一些可能影響轉(zhuǎn)化效率的因子進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而得到92％的高效轉(zhuǎn)化頻率。同時(shí)，將一個(gè)來源于小麥、編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的耐鹽基因TaNHX2轉(zhuǎn)到百脈根中，并對(duì)其耐鹽性進(jìn)行鑒定，從而驗(yàn)證此系統(tǒng)作為基因功能研究平臺(tái)的實(shí)用性。在此基礎(chǔ)上，將大豆中克隆的GmSOC1基因轉(zhuǎn)到了百脈根中使其過表達(dá)，導(dǎo)致了百脈根提前開花，從而驗(yàn)證了此基因促進(jìn)開花的功能，同時(shí)也說明了此轉(zhuǎn)化平臺(tái)可以用于逆境生物學(xué)與發(fā)育生