1、中國協(xié)和醫(yī)科大學博士學位論文抗KDR基因工程抗體的研制及生物學活性研究姓名：李容申請學位級別：博士專業(yè)：分子藥理學指導教師：楊純正朱禎平20040501中∞匱攀科學m中l(wèi)協(xié)p醫(yī)科太掌博女目Rt畢mi達量可達2mg／L培養(yǎng)基。表達產物經抗Etag親和層析純化，獲得純度在90％以上的KDR胞外III區(qū)融合蛋白。進一步使用純化可溶性KDR胞外III區(qū)融合蛋白作為抗原免疫小鼠，采用細胞融合技術制各單克隆抗體。經過多輪交叉篩選，我們最終獲得了一株

2、能穩(wěn)定分泌抗KDR胞外III區(qū)單抗的雜交瘤細胞株YaomlD3。體外生物活性研究表明，該單克隆抗體不僅可與可溶性KDR胞外III區(qū)蛋白抗原及細胞表面表達的KDR結合，還可競爭性抑制VEGF。與可溶性KDR胞外III區(qū)蛋白抗原的結合，阻斷VEGF。刺激內皮細胞表面KDR酪氨酸激酶受體磷酸化，并可顯著抑制VEGF。；誘導臍靜脈內皮細胞增殖、遷移及體外三維膠原模型上內皮細胞毛細血管樣結構的形成，具有潛在的抗腫瘤血管新生臨床應用價值。為克服鼠源

3、性單抗自身固有的一些缺陷，我們對其進行了基因工程抗體的改造。通過采用通用簡并性引物，成功克隆了抗KDR單克隆抗體YaomlD3輕、重鏈可變區(qū)基因，并采用(Gly。Ser)。柔性連接短肽將重、輕鏈可變區(qū)基因前后連接為單鏈抗體片段，在大腸桿菌中獲得了表達。表達產物主要以包涵體形式存在，經變性、純化、透析復性，最終得到能特異性與KDR表達陽性的HUVEC細胞結合的活性產物。ELISA及免疫熒光結合實驗表明該單鏈抗體保留了親本單克隆抗體的特異性

4、結合活性，并可競爭性抑制VEGF。與可溶性KDR胞外III區(qū)蛋白抗原的結合，無論是作為靶向診斷治療的載體還是作為雙功能抗體的一臂，均具有廣泛的應用前景。HIT3a是我所研制的鼠源性抗CD3單克隆抗體，并已經過國際人類白細胞分化抗原協(xié)作組的正式命名。在成功構建、表達抗KDR單鏈抗體的基礎上，我們進一步克隆了抗CD3單抗HIT3a和抗KDR單抗YcomlD3輕、重鏈可變區(qū)基因，構建抗KDR／抗CB3Diabody微型雙功能抗體，并在大腸桿菌