1、當(dāng)植物吸收了過多的光能,而不能被光合電子傳遞途徑有效利用時,過剩光能就會降低光合效率從而導(dǎo)致光抑制,甚至光氧化破壞。除了在強光條件下會發(fā)生光抑制,在低溫弱光等逆境條件下植物由于碳同化能力降低對光能的利用減少,也會產(chǎn)生過剩光能從而導(dǎo)致光抑制。為了避免或減少光抑制,高等植物體內(nèi)存在著多種防御機制,其中葉黃素循環(huán)被認為是在環(huán)境脅迫下保護植物光合機構(gòu)免受過剩光能破壞的一種重要的機制。葉黃素循環(huán)是指植物吸收的光能過剩時,雙環(huán)氧的紫黃質(zhì)(V)在紫黃

2、質(zhì)脫環(huán)氧化酶(VDE)的催化下,經(jīng)過中間物單環(huán)氧的花藥黃質(zhì)(A)轉(zhuǎn)化為無環(huán)氧的玉米黃質(zhì)(Z);在暗處,則在玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(ZE)的作用下朝相反的方向進行,將Z重新環(huán)氧化為V,形成一個循環(huán)。依賴于葉黃素循環(huán)的非光化學(xué)猝滅(NPQ)能夠保護植物光合機構(gòu)免受過剩激發(fā)能的破壞。有過剩光能存在時,由紫黃質(zhì)(V)脫環(huán)氧化而積累的玉米黃質(zhì)(Z)也被人們普遍認為對光合機構(gòu)起到至關(guān)重要的保護作用。 本研究從番茄葉片中分離到番茄玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基

3、因,并對該基因的表達和功能進行了分析。結(jié)果表明,該基因的表達并不受光強和溫度的誘導(dǎo),而受晝夜節(jié)律的影響。過量表達該基因可增強番茄植株對光抑制的敏感性,而抑制該基因表達可減輕番茄植株在低溫弱光脅迫下的光抑制程度,影響番茄花的顏色。主要結(jié)果如下： 1.利用同源序列設(shè)計簡并引物,通過RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因的中間片段,通過5’-RACE和3’-RACE分別克隆到5’和3’片段,拼接后設(shè)計特異引物擴增到全長

4、cDNA。命名為LeZE(EF581828)。該基因全長為2437bp,ORF為2010bp,編碼669個氨基酸,分子量約為73 kDa。同源序列比較發(fā)現(xiàn),番茄玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因的序列與馬鈴薯、煙草、胡蘿卜、葡萄的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因的序列同源性較高。結(jié)構(gòu)同源性分析表明LeZE有四個序列保守的結(jié)構(gòu)域,block I和block II為脂質(zhì)蛋白運載家族的特征區(qū)域,block Ⅲ是黃素蛋白單加氧酶區(qū)域以及block IV的FHA結(jié)合區(qū)域,

5、它們組成了一個重要的催化位點。 2.Northern雜交結(jié)果表明,LeZE基因在番茄不同器官中呈非特異性表達,在葉綠素含量高的組織中表達量較高。同時,該基因在低溫弱光和強光處理的24小時晝夜循環(huán)中都存在著相似的晝夜節(jié)律的表達模式,并不受溫度和光強的影響。Southern雜交結(jié)果表明,LeZE基因在番茄基因組中是單拷貝的。 3.將獲得的LeZE基因與含有35S啟動子的pBI121載體重組,分別構(gòu)建了正義和反義表達載體,利用

6、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄,用PCR及Northern雜交的方法對帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄植株進一步檢測,結(jié)果證明成功地獲得了轉(zhuǎn)正義和反義基因的番茄植株。與野生型植株相比,過量表達LeZE基因的番茄葉片中A和z的含量降低,而V的含量增加,脫環(huán)氧化狀態(tài)較野生型低。LeZE基因表達發(fā)生沉默的番茄植株中Z大量積累,而A和V的含量非常低,脫環(huán)氧化狀態(tài)保持非常高的水平。 4.構(gòu)建了原核表達載體pET-LeZE,并在大腸桿菌BL21中表達融合

7、蛋白,將強誘導(dǎo)帶切下,溶于PBS獲得抗原,免疫小白鼠,其抗血清效價為1:500。Western雜交表明,轉(zhuǎn)正義植株中LeZE基因已在蛋白水平過量表達。另外分別對低溫弱光和強光處理的野生型番茄進行了Western雜交分析。結(jié)果表明,LeZE在蛋白水平的表達始終處在穩(wěn)定的水平,基本不受光強和溫度的影響。 5.在低溫弱光(4℃,100 μmol m-2 s-1)和強光(1200 μmol m-2s-1)脅迫條件下,野生型和轉(zhuǎn)正義基因株

8、系T1-1和T1-10株系的NPQ及葉黃素循環(huán)脫環(huán)氧化狀態(tài)(A+Z)/(V+A+Z)都增加,但野生型的增加更為明顯。在低溫弱光及強光脅迫條件下,依賴葉黃素循環(huán)的NPQ能夠耗散過剩激發(fā)能,而轉(zhuǎn)基因株系比野生型耗散能力下降。強光處理過程中,與野生型相比轉(zhuǎn)正義基因株系的Fv/Fm降低更明顯,且野生型的Fv/Fm恢復(fù)較快,轉(zhuǎn)基因株系的Fv/Fm恢復(fù)較慢,野生型番茄的Fv/Fm可以在24 h內(nèi)恢復(fù),而T1-1和T1-10株系的Fv/Fm在24 h

9、時分別恢復(fù)了93.7％和94.1％。與在強光下類似,T1-1和T1-10株系的Fv/Fm在低溫脅迫過程中降低的程度比野生型大,而恢復(fù)較慢,恢復(fù)12h時野生型的Fv/Fm完全恢復(fù),但轉(zhuǎn)基因株系24h才完全恢復(fù)。這表明LeZE的過量表達加重了PSII的光抑制程度,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因番茄的PSII反應(yīng)中心受傷害較嚴重。強光脅迫6h和12h,野生型和轉(zhuǎn)基因番茄的放氧速率降低非常顯著,低溫弱光處理6h和12h,野生型和轉(zhuǎn)基因番茄的放氧速率也都降

10、低,但下降程度不如強光處理下的明顯。這表明由于LeZE的過量表達降低了低溫弱光和強光脅迫下放氧復(fù)合體的穩(wěn)定性,使光合機構(gòu)所受到的傷害加重。在低溫弱光處理過程中轉(zhuǎn)正義基因植株與野生型的氧化態(tài)P700都降低,且區(qū)別不大。經(jīng)過12h的處理,T1-1,T1-10和野生型的O2-含量分別增加了82.1％,76.8％和66.5％,H2O2含量分別增加了93.4％,87.8％和80.3％。轉(zhuǎn)基因株系中O2-和H2O2含量增加的程度明顯高于野生型。另外

11、,在低溫處理過程中,轉(zhuǎn)正義基因植株和野生型的MDA含量都增加,但轉(zhuǎn)正義基因植株的MDA含量增加的較多。 6.在田間生長的番茄野生型和轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過長期強光適應(yīng),它們的放氧和葉綠素a/b比在弱光下生長的野生型和轉(zhuǎn)基因植株高,而總?cè)~綠素含量比弱光下低。轉(zhuǎn)正義基因與野生型之間的差別不大。這些結(jié)果表明,在強光下生長的番茄植株比弱光下生長番茄植株有更強的光合能力和較小的捕光天線,以適應(yīng)強光條件。在夏季正午1980 μmolm-2 s-1的

12、光下,野生型和轉(zhuǎn)正義基因植株的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和實際光化學(xué)效率(φPSII)沒有差別。兩個轉(zhuǎn)正義基因株系的脫環(huán)氧化狀態(tài)均低于野生型植株,但是與野生型相比,轉(zhuǎn)基因株系有較高的總抗壞血酸含量。另外轉(zhuǎn)基因株系中SOD的活性也要高于野生型。APX的活性在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中基本沒有差異。 7.抑制LeZE的表達不影響過剩光能脅迫下的NPQ。在轉(zhuǎn)反義基因植株中Z大量積累而V和A的含量非常低。在強光和低溫弱光脅迫后,轉(zhuǎn)反義基因植

13、株脫環(huán)氧化狀態(tài)始終保持很高的水平。在強光和低溫脅迫過程中野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株的NPQ都上升,但兩者的NPQ基本沒有差別。這表明Z在PSⅡ熱耗散中可能不起決定性的作用。 8.在強光脅迫下野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株的放氧速率和Fv/Fm都降低,但是野生型與轉(zhuǎn)反義基因植株間沒有差別。在低溫弱光脅迫12h后野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株的放氧速率都降低,但野生型降低的更為明顯。12h脅迫后野生型,(-)1和(-)5植株的放氧速率分別下降到原來的4

14、2.3％,60.8％和58.7％。低溫弱光脅迫下野生型與轉(zhuǎn)反義基因植株的Fv/Fm均下降野生型下降更為明顯。低溫脅迫12h后野生型,(-)1和(-)5的放氧速率分別下降了10.5％,7.1％和7.9％。在低溫弱光處理過程中轉(zhuǎn)反義基因植株與野生型的氧化態(tài)P700都降低,野生型植株P(guān)700的下降更為顯著。 野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株的SOD和APX活性在低溫弱光處理前6個小時內(nèi)先有所上升,之后開始下降,野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株間酶活性差別

15、不大。但是野生型植株中O-2和H2O2含量明顯高于轉(zhuǎn)反基因株系。低溫處理后,(-)1,(-)5和野生型植株中O-2含量分別增加了37.6％,42.5％和82.7％,H2O2含量分別增加了39.5％,37.9％和84.8％。經(jīng)低溫弱光處理后,野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株中MDA含量都增加,野生型中MDA含量增加更為顯著,低溫脅迫12小時后野生型,(-)1和(-)5中MDA含量分別增加到131.5％,110.8％和115.7％。另外轉(zhuǎn)反義基因植株