1、蚊媒傳播的瘧疾是一種嚴(yán)重危害人類健康的熱帶傳染病，在全世界人群中具有很高的發(fā)病率和致死率，影響流行地區(qū)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展，威脅著100多個(gè)國(guó)家近40％的世界人口，在熱帶和亞熱帶地區(qū)尤為嚴(yán)重。雖然經(jīng)過(guò)瘧疾工作者長(zhǎng)期不懈的努力探索，但是目前全世界每年大約有3～5億人感染，約1～3百萬(wàn)患者因瘧疾感染而死亡，其中絕大多數(shù)是五歲以下的兒童。在我國(guó)南方地區(qū)，尤其是山區(qū)，在特定的環(huán)境下仍有大規(guī)模流行的可能。近年來(lái)，隨著瘧原蟲(chóng)多藥抗性株的出現(xiàn)與迅速擴(kuò)散以及

2、蚊媒對(duì)殺蟲(chóng)劑耐受性的增加，而目前又無(wú)有效的抗瘧疫苗，這給瘧疾防治工作帶來(lái)很大的困難。瘧疾控制工作正面臨巨大的挑戰(zhàn)，尋求新型、高效、安全的瘧疾控制策略已迫在眉睫。 瘧疾由感染性蚊媒叮咬傳播，瘧原蟲(chóng)子孢子進(jìn)入血循環(huán)后可迅速粘附并侵入肝細(xì)胞，完成紅外期增殖之后才侵入紅細(xì)胞導(dǎo)致瘧疾發(fā)作。所以干擾裂殖子在肝細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育是防止瘧疾傳播與臨床癥狀出現(xiàn)的關(guān)鍵。因此研制靶向紅外期瘧原蟲(chóng)的疫苗不僅可防止紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)導(dǎo)致的病理?yè)p傷，還可阻斷配子體傳播

3、。然而宿主肝細(xì)胞、肝組織所產(chǎn)生的高背景干擾，以及難以獲得足量高純度肝期瘧原蟲(chóng)的技術(shù)障礙嚴(yán)重阻礙了瘧原蟲(chóng)紅外期的研究。但隨著分子生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，瘧原蟲(chóng)紅外期方面的研究已經(jīng)越來(lái)越受到人們關(guān)注。 瘧原蟲(chóng)抗原差異與變異十分普遍，并具有非常復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)和眾多不同的抗原表位，多數(shù)抗原表位在生活史不同時(shí)期具有階段特異性，此外瘧原蟲(chóng)還存在種、株特異性及抗原性弱等特點(diǎn)，侵入宿主體后可引起復(fù)雜的免疫反應(yīng)。T細(xì)胞免疫在瘧原蟲(chóng)引起的免疫應(yīng)

4、答中具有至關(guān)重要的地位，因此，研究誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的共刺激分子在紅外期免疫中的作用是瘧疾治療及疫苗研制的基礎(chǔ)。 因此本課題以分離獲得的約氏瘧原蟲(chóng)子孢子經(jīng)尾靜脈注射感染大鼠，建立約氏瘧原蟲(chóng)-斯氏按蚊-哺乳動(dòng)物宿主模型，對(duì)紅外期瘧原蟲(chóng)在宿主體內(nèi)發(fā)育變化以及宿主免疫系統(tǒng)接受瘧原蟲(chóng)刺激后所產(chǎn)生免疫應(yīng)答的兩個(gè)方面進(jìn)行研究：一方面應(yīng)用差異顯示PCR(differentialdisplayPCR，DD-PCR)技術(shù)篩選約氏瘧原蟲(chóng)紅外期cDNA，

5、經(jīng)比較分析獲得的差異序列，克隆至TA載體，根據(jù)序列同源分析和功能預(yù)測(cè)結(jié)果，推測(cè)可能與瘧原蟲(chóng)紅外期發(fā)育相關(guān)的基因；另一方面采用RT-PCR與直接免疫熒光反應(yīng)、激光共聚焦技術(shù)相結(jié)合的方法，從基因和共刺激分子表達(dá)情況對(duì)宿主針對(duì)瘧原蟲(chóng)抗原刺激產(chǎn)生的免疫反應(yīng)進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面： 1.針對(duì)瘧原蟲(chóng)基因A+T含量高(＞70％)的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變常規(guī)DD-PCR引物的A+T含量，設(shè)計(jì)能從肝組織和瘧原蟲(chóng)混存樣本中特異擴(kuò)

6、增瘧原蟲(chóng)基因的A+T含量60％的引物，與DD-PCR技術(shù)相結(jié)合，繞過(guò)了純化裂殖子的技術(shù)屏障，特異擴(kuò)增瘧原蟲(chóng)基因。將得到的核酸序列登陸GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)Blast查詢，并進(jìn)行序列同源性比對(duì)、分析，結(jié)果顯示在21個(gè)待測(cè)克隆中：有8個(gè)與約氏瘧原蟲(chóng)紅外期相關(guān)基因(PyHs4、PyHs5、PyHs6、Pyrts7、PyHs8、PyHs9、PyHslO、PyHs11)；其中PyHs4與約氏瘧原蟲(chóng)乙酰葡萄糖胺磷酸變位酶(Phosphoacet

7、ylglucosaminemutase，AGM)具有相似性，PyHs5與約氏瘧原蟲(chóng)紅細(xì)胞膜蛋白3(Erythrocytemembranceprontein，EMP3)具有同源性，PyHs6、PyHs7、PyHs8、PyHs9、PyHs10、PyHs11為功能未知基因。發(fā)現(xiàn)、鑒定的瘧原蟲(chóng)差異基因，為進(jìn)一步研究瘧原蟲(chóng)紅外期生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。 2.采用RT-PCR方法對(duì)不同時(shí)相點(diǎn)宿主免疫相關(guān)基因B7.1、B7.2、TG

8、F-β、IFN-γ進(jìn)行定性、定量分析，探討感染瘧原蟲(chóng)后哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)免疫相關(guān)基因變化情況：在宿主體感染約氏瘧原蟲(chóng)后2～72h，B7.1表達(dá)幾乎沒(méi)有變化；B7.2、TGF-β、IFN-.γ轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P＜0.05)。該結(jié)果顯示瘧原蟲(chóng)侵入可能引發(fā)哺乳動(dòng)物機(jī)體免疫防御、免疫調(diào)控等一系列相關(guān)反應(yīng)。將直接免疫熒光反應(yīng)和激光共聚焦技術(shù)相結(jié)合，觀察瘧原蟲(chóng)感染后共刺激分子B7.1、B7.2的表達(dá)定位情況，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在所選擇的時(shí)相區(qū)間內(nèi)，B7.1

9、、B7.2分子表達(dá)有升高趨勢(shì)，其中B7.1分子上升速度較緩慢在72h后開(kāi)始下降，而B(niǎo)7.2分子上調(diào)迅速在48h達(dá)到峰值后于72h出現(xiàn)回落；在瘧原蟲(chóng)感染后的2～72h，B7.2的表達(dá)水平始終高于B7.1(P＜0.05)。此外，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示：瘧原蟲(chóng)感染后，B7.1、B7.2分子在巨噬細(xì)胞的表達(dá)隨著時(shí)間點(diǎn)推延從細(xì)胞漿、細(xì)胞核逐漸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜。根據(jù)該現(xiàn)象我們可以推測(cè)：接受瘧原蟲(chóng)刺激后，共刺激分子開(kāi)始活化，其合成、表達(dá)增加并可能與