![](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/19/12/dbee609d-93a7-484b-88d0-b99e42dee5ed/dbee609d-93a7-484b-88d0-b99e42dee5edpic.jpg)
![乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細胞的內(nèi)吞機制研究.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/19/12/dbee609d-93a7-484b-88d0-b99e42dee5ed/dbee609d-93a7-484b-88d0-b99e42dee5ed1.gif)
版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus),為有包膜的單正鏈RNA病毒。JEV為流行性乙型腦炎的病原體,主要以蚊蟲為媒介進行傳播,感染后引發(fā)嚴重的急性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,對人類健康威脅巨大。乙型腦炎主要流行于東亞、東南亞地區(qū),近年來其發(fā)病率有明顯上升的趨勢,可見JEV感染仍然是嚴重的公共衛(wèi)生問題,因而對JEV致病機理和
2、預(yù)防手段的研究已成為亟待解決的前沿課題。
病毒感染宿主細胞必須經(jīng)過吸附、穿入細胞內(nèi)、脫殼、生物合成、病毒顆粒的裝配、釋放這樣一個完整的復(fù)制周期,這實際上是病毒與宿主細胞相互作用的過程。為了有效感染宿主細胞,病毒必須先要穿入細胞內(nèi)到達特定區(qū)域才能啟動并完成自我復(fù)制。大多數(shù)包膜病毒與靶細胞結(jié)合以后利用細胞內(nèi)吞方式作為穿入宿主細胞的途徑,這些內(nèi)吞途徑包括:網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(Clathrin-mediated endocytos
3、is)、膜穴樣凹陷介導(dǎo)的內(nèi)吞(Caveola-mediated endocytosis)、巨胞飲作用(Macropinocytosis)和網(wǎng)格蛋白、膜穴樣凹陷非依賴型內(nèi)吞(Clathrin-and Caveola-independent endocytosis)等。黃病毒屬病毒入胞途徑多樣且復(fù)雜,甚至同一種病毒的不同亞型入侵同一種細胞的內(nèi)吞機制也不相同;然而,關(guān)于JEV如何利用宿主細胞固有運輸元件完成病毒內(nèi)吞,及其精確的調(diào)控機制未見報道
4、。
本課題以大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞(B104細胞)為研究對象,針對JEV(疫苗株SA14-14-2株)的入胞過程,通過化學(xué)抑制劑阻斷、細胞內(nèi)過表達顯性抑制突變體以及RNA干擾(RNAi)等方法,系統(tǒng)分析了JEV利用何種宿主細胞元件,通過何種內(nèi)化途徑侵入神經(jīng)細胞。本研究首先建立了JEV感染的神經(jīng)細胞模型,并通過病毒動力學(xué)實驗,分析JEV入侵B104細胞的內(nèi)化速率及動力學(xué)特征。然后,選用針對不同細胞內(nèi)吞途徑的化學(xué)抑制劑分別阻斷各
5、條內(nèi)吞途徑,包括網(wǎng)格蛋白依賴的途徑、膜穴樣凹陷依賴的途徑、發(fā)動蛋白(Dynamin)依賴的途徑、膽固醇(Cholesterol)依賴的途徑、以及低pH依賴的途徑等,觀察上述處理對JEV和單周期JEV假病毒(JEVpv)入侵神經(jīng)細胞的影響。繼而,通過外源轉(zhuǎn)染特異性的顯性抑制突變體或小干擾RNA,破壞各內(nèi)吞途徑的關(guān)鍵分子,進一步分析和確認JEV入侵所依賴的內(nèi)吞途徑。在以上研究基礎(chǔ)上,通過化學(xué)抑制劑阻斷法,觀察JEV不同基因型病毒株入侵B10
6、4細胞的內(nèi)吞途徑是否存在株特異性;同時,采用化學(xué)抑制劑阻斷法比較分析JEV入侵神經(jīng)細胞和非神經(jīng)細胞的內(nèi)吞途徑的異同。
本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
1.JEV入侵大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞不依賴網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑
通過網(wǎng)格蛋白抑制劑Chlorpromazine、細胞內(nèi)過表達EPS15蛋白顯性抑制突變體以及下調(diào)網(wǎng)格蛋白表達等方法,可阻斷網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑;然而上述處理并不影響JEV和JEVpv的
7、入侵,提示JEV入侵B104細胞不通過網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞途徑。
2.JEV入侵大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞依賴發(fā)動蛋白
利用發(fā)動蛋白抑制劑Dynasore、外源轉(zhuǎn)染DynaminⅡ K44A顯性抑制突變體或針對Dynamin的特異性小干擾RNA,能夠破壞發(fā)動蛋白的功能,并明顯抑制了JEV和JEVpv的內(nèi)吞,表明JEV入侵B104細胞依賴發(fā)動蛋白的作用。
3.JEV通過膜穴樣凹陷(Caveola)介導(dǎo)的內(nèi)
8、吞途徑入侵大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞
當B104細胞與膽固醇抑制劑MβCD和Filipin作用后,細胞膜膽固醇及Caveola的結(jié)構(gòu)完整性被破壞。這兩種抑制劑能夠明顯的抑制JEV和JEVpv的入侵,提示JEV的入侵依賴膽固醇和Caveola。在靶細胞內(nèi)過表達Caveolin-1顯性抑制突變體或下調(diào)Caveolin-1的表達,可阻斷Caveola介導(dǎo)內(nèi)吞的功能,并顯著抑制了JEV的入侵能力。此外,采用化學(xué)抑制劑Genistein抑
9、制Caveola內(nèi)吞途徑的信號通路,也能夠明顯地抑制JEVpv的內(nèi)吞。為了更直觀的檢測JEV的內(nèi)吞途徑,我們通過免疫熒光法標記Caveola依賴型內(nèi)吞途徑標志分子霍亂毒素B(CTB)以及Caveolin-1,并觀察在病毒內(nèi)吞過程中它們與JEV病毒顆粒的分布情況。激光共聚焦結(jié)果顯示,絕大多數(shù)JEV病毒顆粒與胞內(nèi)CTB以及Caveolin-1分子共定位。以上結(jié)果表明JEV通過膜穴樣凹陷(Caveola)介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵B104細胞。
10、> 4.JEV入侵大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞不依賴細胞巨胞飲作用
通過EIPA或Wortmannin阻斷細胞的巨胞飲途徑,或干擾PI3K表達以抑制巨胞飲依賴的信號通路,均不能抑制JEV和JEVpv的入侵,提示JEV入侵不依賴細胞巨胞飲作用。
5.JEV入侵大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞依賴酸性pH環(huán)境
利用內(nèi)體酸化抑制劑Chloroquine和Ammonium Chloride來提升內(nèi)體pH能夠明顯抑制J
11、EV的入侵。在維持內(nèi)體低pH環(huán)境中發(fā)揮質(zhì)子泵作用的VATPase被下調(diào)后,JEVpv的感染能力也受到顯著抑制,提示JEV入侵依賴內(nèi)體酸性pH環(huán)境。
6.JEV入侵大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞的內(nèi)吞途徑不存在株特異性
采用不同化學(xué)抑制劑阻斷各條內(nèi)吞途徑,分析對JEV基因Ⅲ型病毒株SA14和基因Ⅰ型病毒株SH-53入侵的影響。我們發(fā)現(xiàn),這兩種基因型的JEV病毒株與疫苗株SA14-14-2株的入侵方式相同,均通過Caveo
12、la介導(dǎo)的、發(fā)動蛋白和pH依賴型的內(nèi)吞途徑入胞,表明JEV入侵B104細胞所依賴的內(nèi)吞途徑不存在株特異性。
7.JEV入侵非神經(jīng)類細胞不同于入侵大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞所依賴的內(nèi)吞途徑
分別將針對不同內(nèi)吞途徑的化學(xué)抑制劑作用于B104、Vero、CHO和Huh7細胞分析對JEV入侵的影響。結(jié)果顯示,JEV通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵Vero,CHO和Huh7細胞;而入侵B104細胞則通過Caveola介導(dǎo)的內(nèi)吞
13、途徑,提示JEV入侵神經(jīng)類細胞所依賴的內(nèi)吞途徑不同于其它非神經(jīng)細胞。
綜上所述,本研究系統(tǒng)分析了JEV入侵大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞的內(nèi)吞途徑及作用機制,證明JEV入侵B104細胞是通過膜穴樣凹陷(Caveola)介導(dǎo)的,發(fā)動蛋白和pH依賴型的內(nèi)吞途徑。這種內(nèi)吞途徑有別于JEV感染非神經(jīng)細胞的入侵方式,也與其它黃病毒屬成員的內(nèi)吞機制不同,可能與JEV的神經(jīng)嗜性和致病性相關(guān)。闡明JEV入侵神經(jīng)細胞過程中所利用的固有元件,以及精確的
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細胞的機制研究.pdf
- 乙型腦炎病毒強弱毒毒力差異的分子機制研究.pdf
- 日本乙型腦炎病毒對內(nèi)皮細胞的活化與相關(guān)機制的研究.pdf
- 乙型腦炎病毒與樹突狀細胞的互作研究.pdf
- 脂筏對丙型肝炎病毒、日本腦炎病毒和腸道病毒71型細胞入侵的影響及其機制研究.pdf
- 副粘病毒入侵宿主細胞的機制研究.pdf
- 49721.細胞內(nèi)鉀離子穩(wěn)態(tài)參與神經(jīng)細胞凋亡機制的研究
- 乙型腦炎重組桿狀病毒疫苗的研究.pdf
- 乙型腦炎病毒復(fù)制與細胞自噬的相互作用.pdf
- 金石墨納米囊的細胞內(nèi)吞機制研究.pdf
- 乙型腦炎病毒感染U251細胞microRNA表達譜的研究.pdf
- 應(yīng)用siRNAs抑制乙型腦炎病毒復(fù)制及乙型腦炎“自殺性”DNA疫苗研究.pdf
- 20719.神經(jīng)細胞的圖形適應(yīng)機制研究
- 神經(jīng)細胞內(nèi)鈣系統(tǒng)的魯棒性研究.pdf
- 柴石退熱顆粒對乙型腦炎病毒體外感染BHK細胞的影響及流行性乙型腦炎辨證規(guī)律的研究.pdf
- 豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒的研制及豬源乙型腦炎病毒的分離鑒定.pdf
- DDAH在調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞分化及介導(dǎo)藥物抗神經(jīng)細胞凋亡中的作用及機制研究.pdf
- VPA對神經(jīng)細胞損傷保護的分子機制研究.pdf
- 果蠅內(nèi)吞蛋白Shibire對細胞自噬調(diào)節(jié)機制的研究.pdf
- FcαR內(nèi)吞及脫落機制研究.pdf
評論
0/150
提交評論