1、SichuanAgriculturalUniversityMaster，SDegreeDissertationAmplificationandexpressionofIgYantibodygeneagainstavianinfectiousbronchitisvirusZhenzhenDuan(Preventiveveterinarymedicine)DirectedbyYongHuangJune2015中文摘要本研究旨在利用基因工程抗

2、體技術制備雞傳染性支氣管炎]gY抗體，為雞抗體基因的研究和特異性抗體的制備提供相關數(shù)據(jù)，同時也為雞傳染性支氣管炎的治療及診斷提供幫助。為了擴增雞IgY抗體基因全長序列，本試驗首先提取雞脾臟總RNA，然后反轉錄成cDNA，按照NCBI上公布的雞輕鏈抗體基因序列合成特異引物，利用PCR技術擴增出輕鏈ORF序列。由于網(wǎng)上沒有公布出雞IgY抗體基因的重鏈全長序列，因此我們根據(jù)已公布出的重鏈恒定區(qū)序列設計引物分別利用5’RACE和3RACE方法擴

3、增后測序驗證，將驗證正確的兩段序列通過DNAStar軟件拼接后找到ORF序列，再次設計引物利用重疊PCR方法擴增出重鏈OR／：序列。將輕、重鏈擴增出的目的條帶分別連接到克隆載體上，經轉化感受態(tài)細胞DH5ct后，選取單菌落搖菌抽取質粒，經酶切和PCR雙重驗證正確的質粒送往公司測序。序列結果顯示擴增出的輕鏈ORF序列長705bp，編碼234個氨基酸與己公布的序列同源性達到95％；重鏈ORF序列長1716bp，編碼571個氨基酸，其可變區(qū)基因

4、序列符合雞抗體重鏈可變區(qū)基因特征，其恒定區(qū)序列與已公布的雞lgY抗體基因重鏈序列同源性達到99％。說明我們已成功構建擴增雞IgY抗體基因輕、重鏈序列的方法。為了表達雞1BV特異性抗體基因序列，首先將30只1曰齡雛雞隨機分成2組，分別飼養(yǎng)在隔離的動物房中。待母源抗體水平下降后，第一組用弱毒疫苗株4／91進行免疫，14天后進行2免，第二組作為空白組不做處理。一免后每隔7天采集兩組血樣分離血清，間接ELISA法檢測特異性抗體，待抗體水平明顯升

5、高時采集兩組雞脾臟，提取總RNA，擴增抗體基因。發(fā)現(xiàn)輕鏈可變區(qū)之間的變異非常大，而重鏈變異較小。從免疫雞中挑選出一條抗體基因將其定向克隆入表達載體pcDNA31中，構建重組表達載體pcDNA31H和pcDNA31L。將測序正確的兩種重組載體共轉染293T細胞，然后利用間接免疫熒光、RTPCR、間接ELISA等檢測方法對目的蛋白的表達及其特異性進行檢測。間接免疫熒光結果顯示在分別轉染和共轉染的細胞中均可見綠色熒光，而轉染空質粒和未轉染的細