1、目的:研究黃芪苷IV(AST)對H2O2誘導(dǎo)的H9c2細胞氧化損傷的保護作用及其與P13K/Akt信號通路的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.H2O2誘導(dǎo)H9c2細胞氧化損傷模型的建立H9c2細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h,換用無FBS高糖DMEM培養(yǎng)基并加入不同濃度的H2O2作用3,6,12 h。實驗分組:①Control組:加入高糖DMEM培養(yǎng)基；②H2O2100組:加入H2O2終濃度為100μmol/L；③H2O2200組:加

2、入H2O2終濃度為200μmol/L;④H202400組:加入H2O2終濃度為400μmol/L。采用MTT法檢測細胞存活率,選擇適合的H2O2濃度和作用時間,建立H2O2誘導(dǎo)H9c2細胞損傷模型。
　　 2.AST抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2細胞氧化損傷作用及其與P13K/Akt信號通路關(guān)系的研究H9c2細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h,換用無FBS高糖DMEM培養(yǎng)基并加入不同試藥。各組加入H2O2后作用6 h。實驗分組：①Control組:

3、加入高糖DMEM培養(yǎng)基；②H2O2組:加入終濃度為200μmol/L的H2O2；③AST10+H2O2組:同時加入終濃度為10mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；④AST20+H2O2組:同時加入終濃度為20mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；⑤LY294002+H2O2組:LY29400210μmol/L預(yù)處理10 min,再加入終濃度為200μmol/L的H2O2；⑥LY294002+AST10+H2O2組:

4、LY29400210μmol/L預(yù)處理10 min,再同時加入終濃度為10 mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；⑦LY294002+AST20+H2O2組:LY29400210μmol/L預(yù)處理10min,再同時加入終濃度為20 mg/L的AST和200μmol/L的H2O2。采用MTT法檢測細胞存活率；Hochest33258染色、DNA抽提和瓊脂糖凝膠電泳、caspase-3活性檢測細胞凋亡；Western blot檢測

5、H9c2細胞中p-Akt和t-Akt蛋白表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.H2O2誘導(dǎo)H9c2細胞氧化損傷模型的建立H2O2處理3 h,100,200,400μmol/LH2O2組細胞存活率分別為94.6％±4.59,84.7％±15.2,66.3％±14.9；H2O2處理6 h,100,200,400μmol/LH2O2組細胞存活率分別為92.4％±5.33,63.9％±10.1,30.8％±9.83；H2O2處理1

6、2 h,100,200,400μmol/LH2O2組細胞存活率分別為69.4％±10.9,24.7％±3.06,24.7％±2.61；與Control組比較,各組細胞存活率均顯著降低；其中在H2O2濃度為200μmol/L作用6 h條件下,細胞存活率降低程度適中,適于后續(xù)實驗。
　　 2.AST對H2O2誘導(dǎo)的H9c2細胞氧化損傷的影響H2O2組,H9c2細胞存活率顯著降低；caspase-3活性顯著升高；DNA片段彌散程度增強

7、,DNA Ladder明顯；Hoechst染色呈致密濃染,細胞核分裂成碎片。
　　 與H2O2組比較,10 mg/L及20 mg/L的AST均能顯著提高H9c2細胞存活率；顯著降低caspase-3活性；減少Hoechst染色細胞核碎片；減弱DNA片段彌散程度,使DNA Ladder不明顯。
　　 3.AST通過P13K/Akt信號通路抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2細胞氧化損傷分別與10 mg/L及20 mg/L AST比較,

8、加入P13K/Akt抑制劑LY294002后H9c2細胞存活率顯著降低；caspase-3活性明顯升高；Hoechst染色呈致密濃染,細胞核碎片增多:DNA片段彌散程度增強,DNA Ladder明顯。
　　 Western blot結(jié)果顯示,10 mg/L及20 mg/L的AST均可顯著上調(diào)H9c2細胞中p-Akt蛋白表達水平,加入LY294002后P-Akt蛋白的表達被顯著抑制。
　　 結(jié)論:
　　 1.H2O

9、2誘導(dǎo)H9c2細胞氧化損傷模型建立成功,在H2O2200μmol/L作用6 h的條件下,細胞存活率降低程度適中,適于制備模型。
　　 2.10 mg/L及20 mg/L的AST均可通過提高H9c2細胞存活率,減輕H9c2細胞凋亡發(fā)揮抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2細胞氧化損傷的作用。
　　 3.AST可上調(diào)H202誘導(dǎo)的H9c2細胞中的P-Akt蛋白表達水平,且AST的細胞保護作用可被P13K/Akt抑制劑LY294002阻斷,