1、目的:1.確定灶周水腫的性質(zhì)，評價不同干預(yù)措施對腦出血灶周損傷的影響；2.探討凝血酶在腦出血的炎性損傷機制中的作用；3.分析血管淀粉樣變相關(guān)的腦出血的臨床特征和腦出血的病因；4.探討基底節(jié)區(qū)腦出血患者的運動功能障礙與神經(jīng)纖維的完整性之間的關(guān)系。 材料與方法: 一、乳豬腦出血的灶周水腫與神經(jīng)元損傷的實驗研究 1.乳豬的自體血腦葉出血模型：體重8-12kg的小豬，術(shù)前6h禁食，4h禁飲。肌肉注射氯胺酮15mg/kg、

2、阿托品0.02mg/kg，待動物麻醉后俯臥位固定在手術(shù)臺上。參考Wagner等的方法建立豬右側(cè)額葉出血模型。 2.動物分組乳豬28頭，隨機分為5組(3、6、12、24和48h)。各組于相應(yīng)時間點完成MR檢測后，快速放血斷頭取腦，留標(biāo)本。其中凝血酶組與出血模型步驟相同，4例局部注入凝血酶500u；手術(shù)引流組在模型造好后0.5h行MRI檢查，于1-5h以18G的留置針插入血腫內(nèi)以空針負壓抽吸，并以生理鹽水沖洗置換之。 3.磁

3、共振檢查在動物模型成功后分別在0.5、3、6、12、24、48h和72h行動態(tài)MRI檢查，序列T1、T2、T2、T2*、DWI、FLAIR、MRS。于磁共振工作站以eFilm軟件盲法分析圖片，由磁共振專科醫(yī)師盲法進行乳酸含量的定性分析。 4.各組于相應(yīng)時間點完成MR檢測后，快速放血斷頭取腦，留標(biāo)本。 5.主要試劑Bax原位雜交試劑盒，TUNEL試劑盒。 6.透射電鏡檢查德國Zeiss公司產(chǎn)EM10C透射電鏡。不同

4、時間點新鮮腦組織迅速取0.5-1mm3組織塊，經(jīng)戊二醛及鋨酸固定液固定后按常規(guī)電鏡樣品制備程序脫水、滲透、包埋、超薄切片、鈾鉛染色，進行電鏡觀測。 7.末端標(biāo)記原位細胞凋亡檢測(TUNEL)常規(guī)步驟進行，陽性標(biāo)準(zhǔn)：胞核呈藍色為凋亡陽性細胞。 8.Bax基因的原位雜交常規(guī)步驟進行，陽性標(biāo)準(zhǔn)：細胞胞漿著色呈棕黃色。 9.圖像分析切片經(jīng)光鏡觀察后采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)定量分析，每張切片

5、于200倍鏡下由專業(yè)技師隨機選取5個視野，測量凋亡和Bax基因表達陽性細胞的數(shù)量、平均細胞面積和平均吸光度。 二、臨床部分 1.腦組織來源為2001年3月至2004年12月本院神經(jīng)內(nèi)科住院的原發(fā)性腦出血患者，行微創(chuàng)血腫引流治療。共206例，男132例，女74例，年齡34～97歲；血腫量35-144ml。其中93例術(shù)中獲得血腫周圍抽吸出的腦組織。13例術(shù)中注入低分子肝素500IU加0.9％生理鹽水2mL血腫周圍，4h后再抽

6、吸血腫，其中6例患者獲得腦組織。分別留取肝素注入組和非肝素注入組術(shù)中抽吸出的血性液收取5ml，于術(shù)后第4天收取引流物5ml，分別以3000rpm離心10分鐘后分離上清液。 2.腦組織取材方法采用北京萬特?？萍脊旧a(chǎn)的YL-1型顱內(nèi)血腫穿刺針。以CT片為依據(jù)于治療室行簡易立體定向血腫穿刺術(shù)。術(shù)中如有抽出的腦組織，選取新鮮的組織塊迅速以多聚甲醛固定后以石蠟包埋。 3.組織病理學(xué)觀察取腦片進行常規(guī)HE染色(在10×20倍光鏡

7、下觀察)、噬銀染色、剛過紅染色和免疫組化檢測。 4.剛果紅染色采用Freudenthal改良剛果紅染色法[1]，以盲法由病理醫(yī)生光鏡下讀片。陽性標(biāo)準(zhǔn)：微小血管壁內(nèi)呈鮮紅色，細胞核呈藍色。 5.免疫組化：常規(guī)步驟進行，鼠抗β淀粉樣前體蛋白多克隆抗體，生物素標(biāo)記羊抗兔IgG。檢測腫瘤壞死因子的表達。陽性標(biāo)準(zhǔn)：以神經(jīng)纖維或微小血管內(nèi)膜呈棕褐色為Aβ蛋白表達。 6.雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測獲得的引流液中

8、IL-6、IL-10的濃度。 7.銀染采用Bielschowsky氏改良染色法。 8.腦出血患者的功能磁共振基底節(jié)區(qū)腦出血患者25例，隨機分為兩組，分別行單純藥物治療和聯(lián)合微創(chuàng)顱內(nèi)血腫清除術(shù)，于2周內(nèi)及恢復(fù)期以張量彌散成像檢測皮質(zhì)脊髓束的損傷程度、以功能磁共振檢測運動皮層的激活范圍與強度，并與恢復(fù)期運動功能障礙評分作相關(guān)分析。 結(jié)果: 1.腦出血后0.5h血腫周圍出現(xiàn)高信號區(qū)，而此時DWI未發(fā)現(xiàn)異常。動態(tài)

9、MRI序列提示出血后灶周水腫在48h達高峰，對照組0.5、3h水腫程度輕，手術(shù)組的水腫高峰較血腫組延遲。 2.Bax陽性細胞數(shù)于24h達高峰，凋亡陽性細胞計數(shù)24h達高峰，3h與6h之間無顯著性差異，Lac峰主要出現(xiàn)在24、48h組，在3-6h患側(cè)和3h健側(cè)則未檢測出，NAA/Cr呈漸降趨勢，電鏡顯示3-6h灶周神經(jīng)元損傷較輕，于24-48h損傷較重。 3.普通組較肝素干預(yù)組的中性粒細胞計數(shù)多，TNF-a陽性表達細胞計數(shù)

10、兩組無統(tǒng)計學(xué)差異，干預(yù)組術(shù)中與術(shù)后第三天相比IL-6、IL-10濃度比較差異有顯著性。 4.62例腦組織中7例(11.3％)腦片剛果紅染色陽性，較Aβ蛋白免疫組化檢測陽性率低(25.8％)。剛果紅染色陽性率隨著年齡增加呈升高趨勢，無性別差異，與血腫量和再出血無關(guān)，有高血壓病史較無高血壓者低，腦葉出血者高；Aβ蛋白陽性分布與性別、年齡、高血壓病史、血腫量和出血部位之間均無統(tǒng)計學(xué)意義。 5.多元方差分析急性期與恢復(fù)期得分有統(tǒng)

11、計學(xué)差異，但手術(shù)組與藥物組間沒有差異。急性期與恢復(fù)期得分間的相關(guān)分析(R=0.89862，P=0.0002)。輕殘組和重殘組于恢復(fù)期分別進行fMRI測試，癱瘓輕的患者恢復(fù)期執(zhí)行對指運動，RMI、RPMC、SMA、LMI、LPMC均有激活，以RMI、LMI明顯，癱瘓較完全的患者執(zhí)行針刺多個皮質(zhì)功能區(qū)激活。 結(jié)論: 1.腦出血超早期灶周水腫的發(fā)生與血塊收縮有關(guān)，延遲發(fā)生的灶周水腫與凝血酶的毒性有關(guān)，超早期血腫抽吸引流術(shù)能減輕

12、細胞毒性腦水腫。 2.腦出血急性期灶周繼發(fā)性神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)元損傷與代謝障礙在3-6h內(nèi)較輕，在24-48h明顯加重。為減輕繼發(fā)性損傷，宜盡早采取有效的干預(yù)措施。 3.腦出血后血腫周圍存在炎癥損傷機制，局部運用肝素能降低炎癥細胞因子表達，凝血酶可能是腦出血的炎癥反應(yīng)啟動原因之一。 4.血管淀粉樣變相關(guān)的腦出血無性別差異，與無高血壓病史有關(guān)，易發(fā)生腦葉出血。Aβ蛋白免疫組化檢測缺乏特異性，不宜用于病因診斷。

13、 5.腦出血患者聯(lián)合應(yīng)用DTI、fMRI能夠檢測白質(zhì)纖維束的損傷程度，評估預(yù)后。 研究總結(jié):本研究實驗部分以注入自體血乳豬腦葉出血模型為基礎(chǔ)，以1.5T磁共振的EPI軟件的多種序列對腦出血的水腫演變、水腫性質(zhì)和血腫周圍組織的代謝進行系列研究，并結(jié)合灶周組織分子生物學(xué)、組織形態(tài)學(xué)改變，提出超早期灶周水腫的發(fā)生與血塊收縮有關(guān)，延遲發(fā)生的灶周水腫與凝血酶的毒性有關(guān)，超早期血腫抽吸引流術(shù)能減輕細胞毒性腦水腫；腦出血急性期灶周繼發(fā)性神經(jīng)元